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Microbiology and Biotechnology Letters

Research Article(보문)

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Molecular and Cellular Microbiology (MCM)  |  Microbial Genetics, Physiology and Metabolism

Microbiol. Biotechnol. Lett. 2023; 51(3): 280-288

https://doi.org/10.48022/mbl.2306.06006

Received: June 16, 2023; Revised: August 28, 2023; Accepted: August 30, 2023

LPS로 자극된 대식세포에 대한 딸기 줄기의 항염증 효능 검증

Verification of Anti-Inflammatory Effects of Strawberry (Fragaria x ananassa var. ‘Seolhyang’) Stems on Macrophages Stimulated by Lipopolysaccharides

Dan-Hee Yoo1 and In-Chul Lee2*

1College of Fusion and Convergence, Seowon University, Cheongju 28674, Republic of Korea
2Department of Bio-Cosmetic Science, Seowon University, Cheongju 28674, Republic of Korea

Correspondence to :
In Chul Lee,         5229418@daum.net

Abstract

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In strawberry farming, most parts of strawberry stems but the fruit have been dumped. Therefore, this study attempted to investigate the antioxidant and anti-inflammatory effects of strawberry stems which are thrown away after farming. For this, strawberry stem extracts were obtained, using hot water and 70% ethanol. First, total polyphenol contents of the hot water and ethanol extract were checked (265.4 ± 0.12 mg TAE/100 g, 503.88 ± 0.2 mg TAE/100 g). For analysis of antioxidant activities, electron donating ability (EDA) and 2,2'-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) radical scavenging activity were measured. Both extracts increased in a dose-dependent fashion, and similar effects with vitamin C (control group) were confirmed. In terms of cell viability of the hot water and ethanol extracts of strawberry stems, ‘RAW 264.7’ was 99% or higher at 500 μg/ml. In addition, cell experiments were conducted at 50, 100 and 500 μg/ml where cell viability is above 99%. In terms of inhibition of the inflammatory mediator ‘nitric oxide (NO)’, the hot water and ethanol extracts of strawberry stems were 37.9% and 38.8% respectively, confirming the inhibition of NO production. To check anti-inflammatory activities, protein and mRNA expressions of ‘iNOS’ and ‘COX-2’ were measured, using RAW 264.7. Compared to the LPS group, the protein expression of the inflammatory mediators was inhibited in the hot water and ethanol extract-treated groups. The above results confirmed that the hot water and ethanol extracts of strawberry stems are valuable as natural substances with antioxidant and anti-inflammatory activities.

Keywords: Strawberry stems, antioxidant, anti-inflammatory, macrophage

Graphical Abstract


서론

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딸기는 장미과에 속하는 식물로 다년생으로 자라나며, 전세계적으로 다양한 종들이 존재하며 크게 초본성인 Fragaria속과 나무 딸기 류인 Rubus 속으로 나눌 수 있다. 식용하는딸기는 꽃턱이 발달한 것으로 씨방이 발달하여 과실이 되는열매와는 다른 방식이며 씨가 열매 속에 존재하지 않는 특징이 있다[1]. 국내에서 대부분 식용으로 이용되어지고 있으며, 대표적인 원예작물로 노지에서는 3월 초부터 5월 말까지 수확하고 하우스 재배를 통해 연중 생산이 가능한 식물이다. 딸기는 그 종류에 따라 성분 함량이 다르게 구성되어있으나 일반적으로 당분과 유기산이 많으며, 이 외에도 비타민 C, polyphenol류, flavonol류, quercetin, ferulic acid, ellagic acod 등 항산화 물질을 다량 함유하고 있다[2−4]. 딸기 내에 함유되어 있는 Ellagic acid는 체내의 과산화 지질의 형성을 억제시키며, 각 조직의 손상을 예방하고 신체 내의 해독 효소들을 활성화되어 발암 억제에 도움을 주는 효능을 가지고 있으며[5], 피부암[6], 소장암과 간암 등의 발생을 억제하는 효과를 가진 것으로 알려져 있다[7]. 또한 본초강목에서는 딸기는 신장과 간을 보호하고 폐질환에도 효과가 있으며, 피부를 곱게할 뿐만 아니라 검게하는 효과가 있다고 알려져 있다[8]. 다양한 채소류, 과실류와 같은 식용 및약용 작물 등은 식용으로 섭취하는 부위 외에는 사용되지 않고 폐기되는 실정이며, 국내에서도 산지 또는 유통단계에서폐기되는 양은 전체 생산량의 8.2%에 달하며 폐기되는 작물부위를 활용하여 기술 개발을 하는 것이 다양한 작물의 수확지수를 높일 수 있고, 농가 소득 증대와 관련 산업의 확대가 가능할 것이며, 농작물의 폐기물을 줄일 수 있는 긍적적인 효과가 기대될 것이다[9]. 또한 우리 나라에서는 천연 소재를 예로부터 질병치료를 위한 소재로 활용해 왔으며, 최근에는 의약품, 건강기능식품 및 화장품 등으로 적용분야가 확대되고 있으며, 활용제품이 급격히 증가하고 있는 추세이다[10].

염증 반응은 외부로부터 오는 자극에 대한 신체조직의 방어 기작으로 물리적, 화학적 자극에 의한 내부의 손상을 회복하려는 활동 기전이다[11]. 이러한 반응은 인간이 살아가는데 있어서 필수적인 방어 작용이지만 암, 천식, 다발성 경화증 등과 같이 해결되지 않는 질병의 주요 원인이 되어진다[12]. 이러한 과도한 염증반응은 pro-inflammatory cytokines인 tumor necrosis factor (TNF)-α, interleukin (IL)-6와 proinflammatory mediator인 nitric oxide (NO), prostaglandin E2 (PGE2)를 생성하는 염증성 세포를 활성화시키며, 이러한 염증성 매개 인자들은 만성 염증 반응을일으키기 시작한다. 또한 유전자 신호 전달체계를 통하여inducible nitric oxide synthase (iNOS) 및 cyclooxygenase-2 (COX-2)와 같은 단백질 발현은 염증성 매개 인자를 생성 및촉진시키는 역할을 한다[13]. 따라서 이들의 염증 매개 인자들과 pro-inflammatory cytokines의 생성을 억제시킬 수 있는 생리활성 물질에 대한 관심이 높아지고 있다[14].

이와 관련하여 본 논문에서는 딸기 과실부분을 수확한 뒤버려지는 줄기에 대한 항염증 관련 효능을 검증하여 화장품기능성 소재로서 사용 가능성을 확인하였다.

재료 및 방법

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재료 및 시료 추출

본 실험에 사용된 딸기 줄기는 충북 딸기농원에서 열매인딸기를 수확하고 난 뒤 버려지는 줄기를 5월에 채취하여 사용하였으며, 이후 딸기 줄기는 세척하여 열풍건조 및 파쇄한 후 추출하였다. 열수 추출을 위해 시료 무게의 10배 양의증류수를 첨가하여 100℃에서 3시간 동안 환류 냉각하여 추출하였다. 그 후, 부직포를 이용해 1차 여과로 상등액과 침전물을 분리하였으며, 이와 같이 3회 반복 추출하였다. 70%에탄올 추출은 시료 중량의 10배 양의 70% 에탄올을 첨가하여 24시간 동안 실온에서 교반 한 후 부직포를 이용하여 1차여과를 통해 상등액과 침전물은 분리하는 과정을 3회 동일하게 진행하여 수득하였다. 그 후, 상등액은 여과지(Whatman No. 2, No. 4, No. 5)를 이용해 진공펌프로 여과 후, rotary vacuum evaporator를 이용하여 감압농축하여 용액을 제거하였다. 그 후, 농축액을 동결건조하여 powder 형태로 -20℃에 보관하여 본 실험의 시료로 사용하였다. 딸기 줄기의 열수 및 70% 에탄올 추출물은 각각 수율은 25.56%, 20.22% 얻었다.

시약 및 기기

총 폴리페놀 함량 측정을 위해 사용한 tannic acid, Folin-ciocalteu reagent (Folin)은 Sigma Chemical Co. (USA)에서 구입하였으며, Na2CO3은 Kanto Chemical Co. (Japan)에서 구입하여 사용하였다. 항산화 활성 측정을 위해 사용한1-1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), ethanol, ascorbic acid, 2,2'-azinobis-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) 등은 Sigma Chemical Co.에서 구입하여 사용하였다. 세포 생존율을 측정하기 위해 사용한 3-[4,5-dimethylthiazol]-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT)및 dimethyl sulfoxide (DMSO)는 Sigma Chemical Co.에서 구입하여 사용하였다. 단백질 발현량 측정에 사용된 β-actin,염증 발현 인자인 iNOS 및 COX-2의 1차 항체와 anti-mouse인 2차 항체는 Santa Cruz Biotechnology, Inc. (USA)에서 구입하여 사용하였으며, enhanced chemiluminescence (ECL)은Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate Merck Millipore (USA)에서 구입하여 사용하였다. mRNA발현 측정에 사용된 Trizol® reagent는 Thermo scientific ambion® (USA)에서 구입하였으며, Go Script™ Reverse Transcription kits, Accupower® PCR PreMix는 Promega (USA)와 Bioneer (Korea)에서 구입하였으며, prime로 사용된 GAPDH, iNOS와 COX-2는 Bionics (Korea)에서 제작하여 사용하였다.

본 연구에 사용된 기기는 rotary vacuum evaporator (EYELA, Japan), ELISA readers (Molecular Devices, China), CO2 incubator (Pantasonic Healthcare Co., Japan), nano drop (Jcbio, Korea), micro refrigerated centrifuge (Hanil Scientific Inc., Korea), SimpliAmp™ Thermal Cycler (Applied Biosystems, USA), ChemiDoc™ MP Imaging System (Bio-Rad, USA) 등을 사용하였다.

총 폴리페놀 함량 측정

총 폴리페놀 함량을 측정하기 위해 Folin-Denis법[15]을 변형하여 실험을 진행하였다. 시료의 제조는 증류수를 용매로이용하여 2 ml 제조하여 사용하였다. 각 시료에 50% Folin용액 2 ml을 혼합하여 3분간 실온에서 반응시켰다. 이후 10%Na2CO3 2 ml을 혼합하여 1시간 동안 상온에서 암실 상태에서 반응시켜 흡광도 700 nm에서 측정하였다. 표준물질로는tannic acid를 사용하여 표준곡선으로 환산하여 100 g 당 mg의 폴리페놀 함량으로 나타내었다.

전자공여능 측정

전자공여능(electron donating abilities)은 Blois의 방법[16]을 변형하여 측정하였다. 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) 60 µl와 시료를 농도 별로 120 µl씩 넣고 혼합한 후15분 방치한 다음 microplate reader를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다.

전자공여능(%) = (1 − 시료첨가군/무첨가군 흡광도) × 100

ABTS radical 소거능 측정

ABTS 라디칼을 소거하는 원리를 이용하여 항산화력을 측정하고자 하였으며, ABTS assay의 방법[17]을 통해 측정하였다. 7 mM 2,2'-azino-bis (3-ethyl-benthiazoline-6-sulfonic acid)와 2.45 mM potassium persulfate를 혼합하여 실온에서 18시간 동안 반응시켜 ABTS 양이온 라디칼을 형성시킨후 99% 에탄올로 희석시켜 사용하였으며, ABTS 100 µl에농도별로 조제된 시료 100 µl를 첨가하여 700 nm에서 흡광도를 측정하였다.

ABTS radical 소거능(%) = (1 − 시료첨가군/무첨가군 흡광도) × 100

세포 주 및 세포 배양

이후 세포 관련 실험을 위해 사용된 세포 주는 대식세포인 RAW 264.7을 ATCC (USA)에서 분양 받았으며, 세포 배양은 10% FBS 및 1% penicillin/streptomycin (100 U/ml)을 첨가한 DMEM 배지를 이용하여 배양하였다. 세포는 37℃, 5% CO2 incubator에서 18시간 이상 배양한 후 계대하여 본실험에 사용하였다.

세포 생존율 측정(MTT assay)

세포 생존율 측정은 Carmichael의 방법[18]에 따라 측정하였다. 96 well plate에 RAW 264.7 세포를 1×104 cells/well을 분주하였다. 이후 시료를 5, 10, 50, 100, 500, 1,000 µg/ml으로 농도별로 조제하여 첨가한 뒤 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 배양하였다. 2.5 mg/ml 농도로 MTT시약을 조제한 뒤 40 µl를 각 well에 첨가하여 4시간 배양하였다. 배양을 완료한 후 상층액을 제거하고 유기용매인DMSO 100 µl를 분주하여 실온에서 10분 동안 shaking한후 ELISA reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율 측정은 대조군으로 시료를 첨가하지 않은무첨가군과 시료를 첨가한 첨가군의 흡광도를 비교하여 백분율(%)로 표시하였다.

세포생존율(%) = (1 − 시료첨가군/무첨가군 흡광도) × 100

NO 생성 억제 활성 측정

RAW 264.7 세포에 LPS로 유도시켜 생성된 배양액 내의NO 농도를 Green 등의 방법[19]에 따라 배양액 내 존재하는 NO를 측정하였다. RAW 264.7 세포를 6 well plate에2×105 cells/well로 분주하여 24시간 동안 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양한다. 이 후 자극제인 LPS를 10 µg/ml 농도로 LPS 무처리구를 제외한 control 및 시료 농도 구간에처리한 후 2시간 이후 농도 별(50, 100, 500 µg/ml)로 조제한시료용액을 처리하여 18시간 배양한 후 96 well plate에 상층액을 분주한다. 상층액과 동일한 용량의 griess 시약을 첨가하여 상온에서 10분 반응시킨 후 ELISA reader를 이용하여 540 nm에서의 흡광도를 측정하였다. NO 억제 활성 측정은 시료의 무첨가군과 첨가군을 비교하여 백분율로 표시하였다.

NO 생성 억제 활성(%) = (1 − 시료첨가군/무첨가군 흡광도) × 100

Western blot을 통한 단백질 발현 측정

RAW 264.7 세포를 이용하여 염증 반응에 관여하는 인자인 iNOS와 COX-2를 이용하여 시료의 항염증 효능을 확인하였다. RAW 264.7 세포를 100 mm culture dish에1×106 cells/well을 분주한 후 37℃, 5% CO2 incubator에서24시간 동안 배양하였다. 대식세포에 자극제인 LPS를 10 µg/ml 농도가 되도록 처리하여 2시간 후 농도별로(50, 100, 500 µg/ml) 시료를 처리하였다. 24시간 배양한 뒤 배지를 제거한 후 PBS로 2회 세척하였다. 그 후, RIPA buffer와Protease & Phosphatase Single-Use inhibitor Cocktail 100X (100:1)를 사용하여 lysis buffer를 제조하였다. Lysis buffer를 이용해 세포를 용해한 뒤 세포를 용해한 용액을 수거한 후 20분간 4℃, 13,200 rpm에서 원심 분리하였다. 원심 분리 후 BCA protein assay kit를 이용해 상등액의 단백질을 정량하였으며, 이후 10% acrylamide gel에서 전기 영동을 이용하여 loading하였다. 이후 transfer 기기를 이용해polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane를 사용하여 단백질을 옮긴 후 5% skim milk를 tris-buffered saline & tween 20 (TBST)에 녹여 실온에서 1시간 동안 blocking하였다. Primary antibody를 첨가하여 4℃에서 overnight한 다음 TBST를 이용해 10분씩 3회 반복 세척을 실시하였다. 이후 2차 항체를 첨가하여 실온에서 1시간 30분 동안 반응시킨 다음 TBST를 이용해 10분 동안 3회 반복하여 세척하였다. 이후 membrane을 ECL 용액으로 암실 반응시킨 후 ChemiDoc™ MP Imaging System을 통해 밴드를 확인하고정량하였다.

Total RNA 분리 및 cDNA 합성

RAW 264.7 세포를 100 mm culture dish에 1×106 cells/well을 분주하여 24시간동안 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였다. 자극제인 LPS를 10 µg/ml 농도가 되도록처리한 뒤 2시간 후 농도 별(50, 100, 500 µg/ml)로 시료를처리하여 24시간 배양하였다. 이후 배양액을 제거한 뒤 PBS로 2회 세척하여 준비하고, trizol reagent 1 ml을 첨가해 세포를 lysis를 실시하였다. 용해된 세포가 포함된 trizol reagent에 Chloroform 200 µl 첨가 후 10회 흔들어 혼합한후 20분간 4℃, 13,200 rpm에서 원심 분리하였다. 원심 분리가 완료된 후 상층액을 취하여 isopropanol과 1:1 비율로혼합한 다음 10회 정도 천천히 흔들어주었다. 이후 20분간4℃, 13,200 rpm으로 원심 분리하여 pellet을 제외한 상층액을 제거해주어 diethylpyrocarbonate (DEPC) water로 희석한 75% 에탄올을 조제하여 1 ml을 첨가하여 세척하였다. 세척액을 모두 제거해준 후 DEPC water를 50 µl 분주하여 섞어준다. 이 후, nano drop을 이용하여 total RNA량을 측정하였으며, cDNA 합성은 추출된 RNA (2 µg)와 Oligo (dT) 15 primer (500 mg/ml) 1 µl을 섞어준 후 nuclease free water (NW)을 첨가하여 75℃ (5분) 반응한 다음 4℃ (5분)반응해준 후 5X reaction buffer, MgCl2, polymerase chain reaction (PCR) nucleotide mix, reverse transcriptase, rnasin inhibitor, NW를 첨가하여 25℃ (5분), 42℃ (60분), 70℃ (15분), 4℃ (10분) 반응시켜 제조하였다.

Reverse transcription-PCR (RT-PCR)

항염증 효과를 mRNA 발현으로 확인하기 위해 RAW 264.7 세포 내에서 RT-PCR로 이용하여 측정하였다. 합성한cDNA를 PCR PreMix와 primer sequences를 섞은 후 실험을 진행하였다. 실험에서 사용된 primer sequences는 Table 1과 같다. GAPDH는 96℃에서 2분, 96℃에서 10초, 64℃에서 30초, 72℃에서 1분, 72℃에서 10분(30 cycles), iNOS는96℃에서 2분, 96℃에서 10초, 62℃에서 30초, 72℃에서 1분, 72℃에서 10분(35 cycles), COX-2는 96℃에서 2분, 94℃에서 10초, 51℃에서 30초, 72℃에서 1분, 72℃에서 10분(35 cycles)을 실행하였다. 1.5% agarose gel에 1% midori green을 첨가한 후 gel을 제조하였고, 그 후 100 V에서 30분미만으로 전기영동으로 밴드를 확인하였다.

Table 1 . Sequence of the primers used for RT-PCR.

GenePrimerSequence (5’ → 3’)
GAPDHsenseTGA AGG TCG GTG TGA ACG GAT TTG GC
Anti-senseCAT GTA GGC CAT GAG GTC CAC CAC
iNOSsenseAAT GGC AAC ATC AGG TCG GCC ATC ACT
Anti-senseGCT GTG TGT CAC AGA AGT CTC GAA CTC
COX-2senseGGA GAG ACT ATC AAG ATA GT
Anti-senseATG GTC AGT AGA CTT TTA CA


통계 처리

본 연구의 모든 실험 데이터는 동일한 조건으로 3회 반복측정하였으며, 측정값의 평균치와 표준편차(means ± standard deviation, SD)로 표기하였다. 또한 결과의 유의성검사는 SPSS Statistics 23을 사용하여 t-test를 통해 유의값(*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001)을 나타내었다. 유의차검증은 분산분석(analysis of variance: ANOVA)으로 분석후, Duncan’s multiple range test에 의해 p < 0.05 수준에서 검정하였다.

결과 및 고찰

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총 폴리페놀 함량

폴리페놀은 식물계에 많이 분포되어 있고, 한 분자 내에2개 이상의 페놀성 하이드록실 그룹을 가지는 방향족 화합물이다. 폴리페놀은 flavonoid, lignin, phenolic acid, stilbene 계열로 분류되고, 또한 이들 페놀성 물질은 항산화력을 띄는 강력한 능력이 있어 식물에서 유래되는 페놀성 물질은 천연 항상화제로 널리 사용되어진다는 보고가 있다[20].

딸기 줄기 추출물의 폴리페놀 함량 측정을 한 결과 Table 2와 같이 나타내었다. 표준물질로 Tannic acid를 사용하였으며, 각 시료의 100 g당 함유하고 있는 있는 tannic acid의양(tannic acid equicalent; TAE)으로 환산하여 나타내었다. 딸기 줄기의 열수 추출물은 265.4 ± 0.12 mg TAE/100 g이 나타났으며, 딸기 줄기의 에탄올 추출물은 503.88 ± 0.2 mg TAE/100 g의 총 폴리페놀 함량을 나타내었다.

Table 2 . Total polyphenol contents in strawberry (Fragaria x ananassa var. ‘Seolhyang’) stems.

SampleTotal polyphenol (mg TAE/100 g)
FAW265.4 ± 0.12
FAE503.9 ± 0.2*

Results are means ± SD from triplicate experiments. (*p < 0.05, FAW vs FAE). FAW, Strawberry (Fragaria x ananassa var. ‘Seolhyang’) stems extracted with distilled water at 100℃; FAE, Strawberry (Fragaria x ananassa var. ‘Seolhyang’) stems extracted with 70% ethanol at room temperature.

DPPH radical 소거능

DPPH 라디칼 소거 활성은 짙은 보라색을 띄는 라디칼이며, 항산화 물질로부터 전자를 공여받아 라디칼이 환원되는원리이다. DPPH의 색은 짙은 보라색으로 라디칼에 의해 환원되면 노란색으로 변화하며 이러한 흡광도의 변화로 항산화력을 측정하는 방법이다[21].

딸기 줄기의 열수 및 에탄올 추출물의 DPPH 라디칼 소거활성을 측정한 결과 Fig. 1과 같이 나타내었다. 설정한 농도가 증가함에 따라 딸기 줄기 추출물의 DPPH 라디칼 소거능이 증가하는 것을 확인하였다. 50 µg/ml에서 열수 추출물은73.98%, 에탄올 추출물은 81.98%의 효과를 보였으며, 50 µg/ml 농도 이상부터는 유사한 결과를 나타내어 딸기 줄기 열수 및 에탄올 추출물은 전자공여능 측정에서 우수한 효능을가진 것으로 판단된다.

Figure 1.Fig. 1

ABTS radical 소거능

ABTS는 안정한 상태의 자유 라디칼이며 potassium sulfate와 합성되면 녹색의 라디칼을 형성하는데 이때 색이녹색을 띈다. 항산화 물질과 반응했을 때 전자를 받아 녹색에서 투명한 색으로 환원되는 원리를 이용하여 항산화력을측정하는 방법이다. DPPH와 ABTS는 in vitro에서 항산화력을 측정할 때 많이 사용되는 방법으로 색에 따른 흡광도변화를 측정한다는 점에서 비슷하지만, DPPH는 자유 라디칼을 제거하고 ABTS는 양이온 라디칼을 제거한다는 점에서추출물에 따라 어느 라디칼을 제거하는가에 따라 다를 수 있으므로 차이가 나타날 수 있다[22, 23].

딸기 줄기의 열수 및 에탄올 추출물의 ABTS 라디칼 소거능을 측정한 결과 Fig. 2와 같이 나타내었다. ABTS 라디칼 소거능은 농도 의존적으로 활성이 증가함을 확인하였으며, 딸기 줄기 열수 추출물은 100 µg/ml 농도에서 91.65%의 소거능이 나타났고, 딸기 줄기 에탄올 추출물은 50 µg/ml 농도에서 95.82%의 소거능을 나타내었다.

Figure 2.Fig. 2

세포 생존율(MTT assay)

세포 내 미토콘드리아의 환원효소에 의해 환원되어formazan을 형성하게 되고, 죽은 세포에서는 formazan이 형성되지 않으므로 이러한 원리를 이용하여 MTT 시약의 담황색 기질을 formazan과 결합시켜 보라색으로 변화시킨 후 이를 유기용매 등으로 용해시킨 후 섞어주어 이후, 흡광도를이용하여 측정한다. 이처럼 흡광도의 값으로 살아있는 세포수를 측정하는 방법이다[24].

딸기 줄기의 열수 및 에탄올 추출물을 MTT assay를 이용하여 대식세포인 RAW 264.7 내의 세포 생존율을 측정한 결과 Fig. 3과 같이 나타내었다. 딸기 줄기의 열수 및 에탄올추출물을 농도별로 측정한 결과, 500 µg/ml 이하의 농도에서 99% 이상의 세포 생존율이 나타났다. 본 연구에서는 이후 세포 실험을 진행할 때 99% 이상의 세포 생존율을 보이는 50, 100, 500 µg/ml 농도 구간을 설정하여 항염증 효능 실험을 진행하였다.

Figure 3.Fig. 3

NO 생성 억제 활성

세포 내 존재하는 NOS에 의해 L-arginine을 자극하여 무기 유리체인 NO를 생성시키며, 이는 면역반응, 세포독성, 혈관이완 등 여러 생리학적 작용에 관여하며 NO의 발현 정도에 따라 조직 손상과 염증을 유발한다고 알려져 있다. NOS중에서 LPS와 같은 자극제에 의해 자극을 받아 염증을 발현시키는 iNOS는 NO를 생성하게 된다. 이러한 NO의 생성이 필요 이상으로 발현될 경우 다양한 염증 발현과 질병을유발하기 때문에 생체 내의 NO 생성의 양을 조절하는 것은염증의 발현을 억제하는데 중요한 요인으로 보고되고 있다[25].

RAW 264.7 세포를 LPS로 활성시킨 후, 딸기 줄기의 열수및 에탄올 추출물 처리하여 NO의 생성을 측정한 결과를 Fig. 4와 같이 나타내었다. LPS 단독 처리군은 LPS 무처리군에비해 높은 NO 발현량이 나타났다. 각 추출물을 농도별(50, 100, 500 µg/ml)로 처리하였을 때에도 농도 의존적으로 NO생성량이 감소하는 것을 확인하였으며, LPS 처리군과 최종농도인 500 µg/ml 농도의 NO 생성 저해를 비교하였을 때 딸기 줄기 열수 추출물은 37.9%, 딸기 줄기 에탄올 추출물은38.8%의 저해 효과를 나타내었다.

Figure 4.Fig. 4

iNOS 및 COX-2에 대한 단백질 발현 억제 효과

딸기 줄기의 열수 및 70% 에탄올 추출물이 염증성 매개인자인 iNOS 및 COX-2의 단백질 발현에 미치는 영향을 알아보기 위해 RAW 264.7 세포에 50, 100, 500 µg/ml의 시료를 각각 처리한 후 24시간 뒤에 western blot으로 단백질 발현 억제를 측정하여 정량 분석한 뒤 Fig. 5, 6과 같이 나타내었다. 이때 세포의 여러 조건에서도 그 발현 정도의 차이가거의 없는 housekeeping gene인 β-actin을 positive control로 사용하였다. 염증 발현 인자인 iNOS와 COX-2 단백질 발현의 억제량은 최고 농도인 500 µg/ml 농도에서 열수 추출물은 각각 60.4%, 19.9%의 억제 효과를 나타내었고 에탄올추출물은 각각 88%, 14.3%의 억제 효과를 나타내었다.

Figure 5.iNOS, COX-2 protein expression levels of hot water extracts from strawberry (Fragaria x ananassa var. ‘Seolhyang’) stems in RAW 264.7 cells. RAW 264.7 cells (1 × 106 cells/well) were pretreated with LPS (10 μg/ml) for 2 h and then treated water extracts from strawberry (Fragaria x ananassa var. ‘Seolhyang’) stems at an appropriate concentration (50, 100 and 500 μg/ml) for 16 h. iNOS and COX-2 protein expression was determined in RAW 264.7 cells treated with FAW. Results are means ± SD from triplicate experiments. (*p < 0.05, ***p < 0.001 vs LPS alone-treated group)
Figure 6.iNOS, COX-2 protein expression levels of 70% ethanol extracts from strawberry (Fragaria x ananassa var. ‘Seolhyang’) stems in RAW 264.7 cells. RAW 264.7 cells (1 × 106 cells/well) were pretreated with LPS (10 μg/ml) for 2 h and then treated ethanol extracts from strawberry (Fragaria x ananassa var. ‘Seolhyang’) stems at an appropriate concentration (50, 100 and 500 μg/ml) for 16 h. iNOS and COX-2 protein expression was determined in RAW 264.7 cells treated with FAE. Results are means ± SD from triplicate experiments. (**p < 0.01, ***p < 0.001 vs LPS alone-treated group)

RT-PCR을 통한 iNOS 및 COX-2에 대한 mRNA 발현 억제효과

염증 발현 인자인 iNOS와 COX-2의 mRNA 발현량을 측정하기 위해 RT-PCR을 이용하여 본 실험을 진행하였다. 대식세포인 RAW 264.7에 딸기 줄기의 열수 및 에탄올 추출물을 처리한 후 각 mRNA 발현량을 측정한 결과는 Fig. 7, 8에나타내었다. LPS 단독 처리군과 sample 처리군을 비교하였을 때 농도의존적으로 mRNA 발현량이 감소됨을 확인할 수있었으며, iNOS 및 COX-2의 mRNA 발현 억제는 500 µg/ml 농도에서 열수 추출물은 각각 26.6%, 34.9% 억제 효과를나타내었고 에탄올 추출물은 각각 84.1%, 23.1%의 억제 효과를 나타내었다.

Figure 7.iNOS, COX-2 mRNA expression levels of hot water extracts from strawberry (Fragaria x ananassa var. ‘Seolhyang’) stems in RAW 264.7 cells. RAW 264.7 cells (1 × 106 cells/well) were pretreated with LPS (10 μg/ml) for 2 h and then treated water extracts from strawberry (Fragaria x ananassa var. ‘Seolhyang’) stems at an appropriate concentration (50, 100 and 500 μg/ml) for 16 h. iNOS and COX-2 protein expression was determined in RAW 264.7 cells treated with FAW. Results are means ± SD from triplicate experiments. (***p < 0.001 vs LPS alone-treated group)
Figure 8.iNOS, COX-2 mRNA expression levels of 70% ethanol extracts from strawberry (Fragaria x ananassa var. ‘Seolhyang’) stems in RAW 264.7 cells. RAW 264.7 cells (1 × 106 cells/well) were pretreated with LPS (10 μg/ml) for 2 h and then treated ethanol extracts from strawberry (Fragaria x ananassa var. ‘Seolhyang’) stems at an appropriate concentration (50, 100 and 500 μg/ml) for 16 h. iNOS and COX-2 protein expression was determined in RAW 264.7 cells treated with FAE. Results are means ± SD from triplicate experiments. (*p < 0.05, ***p < 0.001 vs LPS alone-treated group)

본 연구는 딸기 줄기 열수 및 에탄올 추출물의 항염증 효과를 구명하기 위해 수행되었다. 딸기 재배 관련 연구와 과육에 대한 효과를 검증하여 식품과 화장품 소재로서 활용하기 위한 연구는 보고되어 있으나, 딸기 부산물인 줄기에 대한 효능을 검증한 연구는 아직 미비한 실정이다. 따라서 본연구에서는 딸기 줄기 열수 및 70% 에탄올 추출물의 염증발현 인자인 iNOS 및 COX-2의 단백질 및 mRNA 발현 억제효과를 측정한 결과를 보아 항염증에 우수한 효과를 나타냄에 따라 천연 기능성 소재로 활용될 수 있는 기초적 자료로활용가능성을 확인하였다.

요약

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딸기는 과육을 제외한 부위는 폐기될 수밖에 없어 활용도가 떨어지는 실정이다. 이에 따라 본 연구에서는 부산물로서 폐기되는 딸기 줄기를 활용하고자 이를 이용하여 항산화 및항염증 효과를 검증하고자 하였다. 용매별로 추출하여 딸기줄기의 열수 및 70% 에탄올을 이용하여 추출 후 실험을 진행하였다. 먼저 딸기 줄기의 열수 및 에탄올 추출물의 총 폴리페놀 함량을 확인하였으며, 그 결과 265.4 ± 0.12 mg TAE/100 g, 503.88 ± 0.2 mg TAE/100 g의 폴리페놀 함량을 확인하였다. 항산화 활성을 측정하기 위해 전자공여능 및2,2’-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS)라디칼 소거능을 이용하여 항산화력을 측정하였다. 두 추출물 모두 농도 의존적으로 증가함을 확인할 수 있었으며, 고농도에서는 항산화력이 우수함을 확인하였다. 이후 항염증효능을 확인하기 위해 대식세포를 이용해 실험을 진행하였다. 먼저 시료의 세포 독성을 확인하고 농도를 설정하고자하였다. 세포 생존율을 측정한 결과, 대식세포인 RAW 264.7에서 딸기 줄기 열수 및 에탄올 추출물 둘다 500 µg/ml 농도에서 99% 이상의 세포 생존율을 확인하였다. 이후 세포 생존율이 99% 이상인 농도구간(50, 100, 500 µg/ml)을 설정하여 이하의 실험을 진행하였다. 염증성 매개 물질로 알려진nitric oxide (NO)의 생성 억제 효과를 확인한 결과, 딸기 줄기의 열수 추출물은 37.9%의 억제 효과가 나타났고, 에탄올추출물은 38.8%의 억제 효과를 확인하여 딸기 줄기 추출물의 NO 생성을 저해하는 효과를 확인하였다. 항염증 활성을확인하기 위해 RAW 264.7 세포를 이용하여 염증 매개 인자인 iNOS, COX-2의 단백질 및 mRNA 발현량을 측정하였다.그 결과, 단백질 및 mRNA의 발현에서 LPS 단독 처리군에비해 딸기 줄기의 열수 및 에탄올 추출물을 처리하였을 때iNOS와 COX-2의 단백질 발현량이 억제됨을 확인할 수 있었다. 본 연구 결과들을 토대로 딸기 줄기의 열수 및 에탄올추출물이 항산화 및 항염증 활성이 우수함을 확인하여 천연소재로서 활용하여 사용할 수 있을 것으로 사료된다.

Conflict of Interest

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The authors have no financial conflicts of interest to declare.

References

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