Article Search
닫기

Microbiology and Biotechnology Letters

보문(Article)

View PDF

Food Microbiology (FM)  |  Bioactive Compounds or Metabolites: Function and Application

Microbiol. Biotechnol. Lett. 2022; 50(3): 337-346

https://doi.org/10.48022/mbl.2207.07002

Received: July 6, 2022; Revised: August 3, 2022; Accepted: August 12, 2022

LPS에 의해 활성화된 대식세포에서 애플망고 껍질(Mangifera indica L. Peel)의 항염증 효능 검증

Verification of Anti-Inflammatory Efficacy of Apple Mango (Mangifera indica L.) Peel in LPS-Activated Macrophage

Hyo-Min Kim1†, Dan-Hee Yoo2†, and In-Chul Lee3*

1College of Pharmacy, Kyungpook National University, Daegu 41566, Republic of Korea
2College of Fusion and Convergence, 3Department of Bio-Cosmetic Science, Seowon University, Cheongju 28674, Republic of Korea

Correspondence to :
InChul Lee,      5229418@hanmail.net

The purpose of this study was to investigate the antioxidant and anti-inflammatory activities of hot water (AMPW) and 70% ethanol (AMPE) extracts of apple mango (Mangifera indica L.) peel. The antioxidant activities were measured using a total polyphenol, electron-donating, 2,2’-azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid] (ABTS) radical scavenging assay. The total polyphenol content of AMPW and AMPE was 66.08 ± 0.62 mg TAE/100 g and 100.13 ± 0.23 mg TAE/100 g, respectively. As a result of measuring the electrondonating ability, at a concentration of 1,000 μg/ml, AMPW and AMPE showed an effectiveness of 86% and 94%, respectively. The ABTS assay showed 80% and 98% respective radical scavenging activity for AMPW and AMPE, at a concentration of 1,000 μg/ml. The cell viability on macrophage cells was performed using a 3-[4,5-dimethyl-thiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazoliumbromide (MTT) assay, and the results showed more than 90% cell viability at a 100 μg/ml concentration. Anti-inflammatory activity was verified by confirming nitric oxide (NO) production inhibitory activity, inducible nitric oxide synthase (iNOS), and cyclooxygenase- 2 (COX-2) protein and mRNA expression inhibitory activity from lipopolysaccharide (LPS)-treated RAW 264.7 cells. The NO production inhibitory effects were measured using the Griess assay, which confirmed 45% and 40% inhibition after treatment with AMPW and AMPE, respectively. Moreover, the protein and mRNA expression of inflammatory-related factors iNOS and COX-2, decreased in a concentrationdependent manner. In conclusion, this study showed antioxidant and anti-inflammatory effects of Mangifera indica L. peel and revealed its promising potential for application as an antioxidant and anti-inflammatory agent.

Keywords: Mangifera indica L. peel, antioxidant, anti-inflammatory, macrophage

Graphical Abstract


옻나무(anacardiaceae)과에 속하는 망고(Mangifera indica L.)는 세계 주요 30대 작물 중 하나로 열대 및 아열대 지역에서 주로 재배되고 있다[1]. 망고의 품종은 지역에 따라 2,000여 종으로 나누어져 있으며 카라바오 망고 품종이 국내에 널리 알려진 노란색 망고이며, 붉은색을 띄는 아윈(Irwin) 품종인 애플망고 또한 망고 품종 중 대표적으로 알려져 있다. 카라바오 망고는 숙성이 된 후 과피가 노란색으로 변하며 섬유질이 없다는 것이 특징이며 이는 주로 필리핀에서 재배되어진다. 이외의 애플망고는 주로 태국과 대만에서 수입되어 판매되어지는데, 씨의 크기가 작아 과육이 많고 껍질이 매우 얇으며, 당도가 높아 소비자들의 수요가 높아지고 있다[2, 3]. 하지만 최근에는 국내 기후가 아열대성으로 변하고 있어 망고, 오렌지, 용과, 바나나, 패션프루츠, 파인애플 등의 열대과일의 재배가 국내에서 증가되어지고 있다. 여수, 제주도 등에서는 망고의 품종 중 애플망고의 재배가 안정적으로 이루어지고 있다[4]. 국외에서 재배되어지는망고는 Navarro 등[5], Lauricella 등[6], Lim 등[7], Alañón등[8], Dhananjaya 등[9], Kim [10]과 같이 과육뿐만 아니라다른 부위들(씨, 껍질, 잎)에 대해 활발히 연구가 진행되어효능이 많이 입증되어져 있다. 현재 폐기물로 버려지는 과일부산물 중 껍질은 과일의 10−32%를 차지하고 있어 이를 활용하는 것은 폐기물 처리 과정에서 생성되어지는 환경 오염요소를 줄일 수 있는 효과를 나타낼 수 있다고 기대되어진다. 폐기되어지는 과일의 껍질에는 폴리페놀, 무기질, 비타민 등 유효성분을 함유하고 있다고 알려져 있다[11]. 망고의부산물인 껍질에는 베타카로틴(β-carotene), 알파카로틴(α-carotene), 카테킨(catechin), 타닌(tannin), 카로티노이드(carotenoid), 갈산(gallic acid), 캠페롤(keampferol) 등의 물질이 함유되어 있다고 보고되며 이러한 물질들은 항산화 활성 및 피부암의 생성을 억제해준다고 알려져 있다[12, 13].

최근 현대사회에서는 경제, 과학, 의학 기술 등의 발전으로 인해 평균 수명이 연장되어 고령화 사회에 접어들었다.또한 도시화와 산업화가 중심이 되며 생물학적, 화학적 유해물질에 대한 노출이 빈번해지고 환경오염, 주거환경 변화, 식생활 변화 등에 의해 생체내의 면역 조절 이상이 나타나게되어 아토피, 알러지 및 염증 반응 등의 염증성 질환 발병이증가하고 있다[14]. 이로 인해 최근 현대인들에게 많이 발생되는 염증성 질환에 대한 예방 및 치료를 위해 염증 매개 물질들을 억제할 수 있는 천연 유래 소재를 활용하여 항염증활성 억제에 관한 연구들이 활발히 진행되고 있다[15].

염증반응은 생체내의 조직 방어 기작 중 하나로서 세균 등의 병원균이 침투하여 감염이 발생하거나 외부에서의 물리적, 화학적 자극으로 인한 손상으로부터 생체를 보호하기 위한 방어기전으로 손상된 세포, 조직들을 재생하려는 반응이다. 이는 활성산소종 뿐만 아니라 염증성 사이토카인이 야기되어 체내 조직의 손상을 유발하여 통증, 발열, 부종, 관절염, 당뇨병 등을 일으켜 기능적 장애를 발생시킨다[1618].손상된 조직을 회복시키기 위해 모이는 면역세포 중 가장 잘알려진 대식세포는 그람 음성균의 세포 외 막에 존재하는lipopolysaccharide (LPS)에 의해 활성화되어진다. LPS에 의해 자극받은 대식세포는 염증성 매개물질의 형성을 촉진시켜 nitric oxide (NO) 및 prostaglandin E2 (PGE2)의 생성을 활성화시킨다[19, 20]. 체내 염증 과정에서 중요한 역할을하는 NO는 L-arginine이 nitric oxide synthase (NOS)에의해 L-citrulline으로 합성되어질 때 생성되는 물질이다[21]. NOS에는 neuronal NOS (nNOS), endothelial NOS (eNOS), inducible NOS (iNOS)의 세가지의 isoform이 존재하는데 nNOS와 eNOS는 세포내에서 지속적으로 존재하고일시적인 발현이 일어나며, iNOS는 사이토카인과 LPS와 같은 특정 자극인자에 의해 지속적으로 다량 생성되어진다. 이렇게 발현된 iNOS가 NO를 생성하게 될 경우 세균을 죽이거나 신체를 보호한다고 알려져 있지만 과량 생성될 경우 정상 조직 세포를 손상시켜 다양한 염증성 질병을 유발시킨다[22, 23]. 세포막의 인지질에서 아라키돈산이 유리되어진 후PGE2의 생성을 촉진시키는 효소로서 Cyclooxygenase (COX)가 존재하며 이는 COX-1, COX-2 두 가지 형태로 분류되어진다. COX-1은 대부분의 조직에서 발현되어 항상성유지에 관여하며 정상적인 생체 기능에서 작용한다. COX-2는 산화적 스트레스, 사이토카인에 의한 자극으로 인해 생성되어지고 대식세포와 같은 세포 내에서만 발현한다. 이에 의한 PGs의 합성은 PGE2를 생성하여 염증반응, 혈관 형성을촉진해 암 발생 등 염증질환을 발생시킨다고 알려져 있다[2427].

최근 국내 기후변화로 인해 열대과일 재배가 활발히 이루어지고 있으며, 열대과일 중에서도 애플망고에 대한 재배가가장 대표적으로 알려져 있다. 이로 인해 국내 소비자들이애플망고에 관한 수요가 증가함에 따라 과육은 많이 소비되고 있지만 이외의 부산물인 껍질은 폐기물로 버려지고 있어본연구에서는 이에 관한 항산화 및 항염증 활성 검증을 통해 새로운 천연물 소재로서 활용가능성을 확인하고자 하였다.

재료 및 시료 추출

본 실험 소재인 애플망고 껍질은 제주도에 위치한 ‘대동농원’에서 원물을 구입하여 과육을 제거한 후 껍질을 수거하였다. 이후 애플망고 껍질은 세척하여 열풍건조 후 파쇄하여 추출하였다. 열수 추출물 제조를 위해 시료 중량의10배 양의 증류수를 용매로 첨가하여 3시간동안 100℃에서환류 냉각 추출 후 부직포를 이용해 상등액과 원물을 분리하기 위해 1차 여과를 진행하였으며, 이와 동일한 방법으로3번 실시하였다. 70% 에탄올 추출물 제조를 위해 시료 중량의 10배인 양을 70% 에탄올을 용매로 첨가하여 1일간(24시간) 실온에서 교반 한 후 부직포를 이용하여 상등액과 원물을 분리하여 동일한 방법으로 3번 반복하여 추출하였다. 그후, 추출된 용매를 진공펌프와 여과지(Whatman No. 5, No. 4, No. 2)로 여과 후, rotary vacuum evaporator (EYELA, Japan)로 감압농축을 진행하였다. 농축이 완료된후 추출물의 동결건조하여 powder 형태로 -20℃에 보관하여 본 실험의 sample로서 사용하였다. 애플망고 껍질의 열수 및 70% 에탄올 추출물은 각각 수율은 21.22%, 21.57% 얻었다.

시약 및 기기

항산화 활성 측정에 사용한 tannic acid, Folin-ciocalteu reagent (Folin), 1-1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), ascorbic acid, 2,2'-azinobis-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS)은 Sigma Chemical Co. (USA), Na2CO3은 Kanto Chemical Co. (Chuo-ku, Japan)에서 구입하였다.세포 독성 측정을 위해 사용한 dimethyl sulfoxide (DMSO)와3-[4,5-dimethylthiazol]-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT)는 Sigma Chemical Co.의 시약을 사용하였다. 단백질 발현 실험에서 사용된 β-actin, 항염증 관련 인자인 iNOS와 COX-2의 primary antibody와 secondary antibody인 anti-mouse 및 anti-rabbit은 Santa Cruz Biotechnology, Inc. (USA)의 antibody를 사용하였으며, Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate을 Merck Millipore (USA)에서 구입하여 enhanced chemiluminescence (ECL)로 사용하였다. mRNA 발현 측정 실험에 사용된 Trizol® reagent는 Thermo scientific ambion® (USA)에서 구입하였으며, Go Script™ Reverse Transcription kits, Accupower® PCR PreMix는 Promega (USA)와 Bioneer (Korea)에서 구입하였으며, primer인 GAPDH, iNOS와 COX-2의 합성은Bionics (Korea)에서 하였으며, 합성된 primer를 구입하여 실험에 사용하였다.

실험에 사용된 기기는 rotary vacuum evaporator (EYELA, Japan), ELISA readers (Molecular Devices, USA), micro refrigerated centrifuge (Hanil Scientific Inc., Korea), nano drop (Jcbio, Korea), CO2 incubator (Pantasonic Healthcare Co., Japan), SimpliAmp™ Thermal Cycler (Applied Biosystems, USA), ChemiDoc™ MP Imaging System (Bio-Rad, USA) 등을 이용하여 실험을 수행하였다.

총 폴리페놀 함량 측정

총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis법[28]을 변형하여 실험을진행하였다. 추출물을 증류수에 희석하여 2 ml 제조한 다음50% Folin 용액 2 ml을 혼합한 후 3분간 실온에서 반응시켰다. 이후 10% Na2CO3 2 ml을 혼합하여 1시간 동안 상온에서 암실 상태로 반응시켜 700 nm의 흡광도에서 측정하였다.표준물질로 tannic acid를 사용하여 표준곡선을 작성한 후100 g 당 mg의 함량으로 나타내었다.

전자공여능(Electron donating activity) 측정

Blois의 방법[29]을 변형하여 전자공여능(electron donating activity)을 측정하였다. 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) 40 µl와 농도별 추출물을 240 µl씩 넣고 혼합하여 15분동안암실 반응 후 다음 microplate reader를 이용해 흡광도 517 nm에서 측정하였다.

전자공여능(%) = (1 − 시료첨가군/무첨가군) × 100

ABTS radical 소거능 측정

ABTS 라디칼을 이용한 항산화력 측정은 ABTS assay의방법[30]에 의하여 측정하였다. 7 mM 2,2'-azino-bis (3-ethyl-benthiazoline-6-sulfonic acid)와 2.45 mM potassium persulfate를 혼합하여 실온에서 15−18시간 동안 방치하여ABTS 양이온 라디칼을 형성시킨 후 99.9% 에탄올로 희석시켜 사용하였으며, ABTS 시약과 시료를 1:1 비율로 첨가하여 흡광도 700 nm에서 측정하였다.

ABTS radical 소거능(%) = (1 − 시료첨가군/무첨가군) × 100

세포 주 및 세포 배양

세포배양을 위해 사용된 세포 주인 대식세포는 RAW 264.7을 ATCC (USA)에서 구입하여 사용하였으며, 세포 배양에 사용된 DMEM 배지는 10% FBS와 1% penicillin/streptomycin (100 U/ml)을 첨가하여 사용하였다. 세포는5% CO2와 37℃의 조건인 배양기에서 18시간 이상 배양한후 계대하였다.

세포 생존율 측정(MTT assay)

Carmichael의 방법[31]을 이용하여 세포 생존율을 측정하였다. 96 well cell culture plate에 RAW 264.7 세포를 각well에 1×104이 되도록 seeding하였다. 이후 시료를 각 농도별로 조제하여 첨가한 뒤 5% CO2와 37℃의 조건인 배양기에서 24시간 배양하였다. MTT 시약을 2.5 mg/ml 농도로제조한 후 40 µl를 각 well에 첨가하여 4시간 배양하였다. 배양을 완료한 후 상층액을 suction하여 제거한 후 DMSO 100 µl를 분주하여 실온에서 10분 동안 shaking한 후microplate reader를 이용하여 흡광도 540 nm에서 측정하였다. 결과를 나타내기 위해 시료를 첨가하지 않은 무첨가군과 시료를 첨가한 첨가군의 흡광도에 대한 백분율(%)로 표시하였다.

세포생존율(%) = (1 − 시료첨가군/무첨가군) × 100

NO 생성 억제 활성 측정

LPS로 유도된 RAW 264.7 세포에서 생성된 배양액 내의NO 농도를 Green 등의 방법[32]에 따라 griess reagent를사용하여 배양액 내 존재하는 NO를 측정하였다. 6 well cell culture plate에 RAW 264.7 세포를 각 well에 2×105 cell로 seeding하여 24시간 동안 5% CO2와 37℃의 조건인 배양기에서 배양한다. 이 후 자극제인 LPS를 10 µg/ml 농도로normal을 제외한 control 및 농도 구간에 처리한 후 2시간 이후 농도 별(10, 50, 100, 500 µg/ml)로 조제한 시료용액을 처리하여 16−18시간 배양한 후 96 well plate에 상층액을 분주한다. 상층액과 동일한 용량의 griess 시약을 첨가하여 10분반응시킨 후 microplate reader를 이용하여 흡광도 540 nm에서 측정하였다. 결과를 나타내기 위해 무첨가군과 첨가군을 비교하여 백분율(%)로 표시하였다.

NO 생성 억제 활성(%) = (1 − 시료첨가군/무첨가군) × 100

Western blot을 통한 단백질 발현 측정

항염증 효과를 확인하기 위해 RAW 264.7 세포를 이용하여 염증 반응에 관여된 인자인 iNOS 및 COX-2를 통해 확인하였다. RAW 264.7 세포를 100 mm cell culture dish에 각well에 1×106 cell을 분주한 후 24시간 동안 배양하였다. 세포에 자극제로 LPS를 사용하였으며, 배양액 내 10 µg/ml 농도가 되도록 하였다. 2시간 후 농도별로(10, 50, 100, 500 µg/ml) 추출물을 처리하였다. 24시간 배양한 뒤 배지를 제거한후 PBS로 2회 세척하였다. 그 후, RIPA buffer와 Protease & Phosphatase Single-Use inhibitor Cocktail 100X을100:1 비율로 lysis buffer를 제조하여 세포를 용해한 후 4℃에서 20분간 13,200 rpm으로 원심 분리하였다. BCA protein assay kit를 이용해 원심 분리가 완료된 상층액의 단백질을 정량 하였으며, 이후 acrylamide gel (10%)에서 전기영동으로 loading하였다. 이후 gel을 polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane에 transfer 기기를 이용하여 단백질을 옮긴 후 tris-buffered saline & tween 20 (TBST)를 용매로 사용한 skim milk (5%)를 제조하여 실온에서 1시간 동안blocking을 진행하였다. Primary antibody를 첨가하여 4℃에서 18시간 이상 반응한 다음 TBST를 이용해 10분 동안 세척하였으며, 3회 실시하였다. 이 후 secondary antibody를첨가하여 1시간 30분 동안 반응시킨 다음 TBST를 이용해10분 동안 세척하였으며, 3회 실시하였다. 이후 암실에서ECL 용액으로 반응시킨 다음 ChemiDocTM MP Imaging System을 통해 밴드를 확인하였다.

Total RNA 분리 및 cDNA 합성

RAW 264.7 세포를 100 mm cell culture dish에 각 well에 1×106 cell을 분주하여 24시간동안 5% CO2와 37℃의 조건인 배양기에서 배양하였다. 자극제인 LPS를 10 µg/ml 농도가 되도록 처리한 뒤 2시간 후 농도별(10, 50, 100, 500 µg/ml)로 시료를 넣고 24시간 동안 반응시켰다. 이후 배양액을 제거하고 PBS로 2회 세척한 뒤 trizol reagent 1 ml을 첨가해 세포를 lysis 하였다. 세포를 용해한 trizol reagent에 200 µl의 Chloroform을 첨가한 후 4℃에서 20분간 13,200 rpm으로 원심 분리하였다. 원심 분리가 완료된 후 상층액을 취하여 isopropanol과 1:1 비율로 혼합한 다음 10회 흔들어주었다. 이후 20분간 4℃, 13,200 rpm으로 원심 분리하여 상층액을 제거하고 pellet만 남겨둔다. Pellet을diethylpyrocarbonate (DEPC) water로 희석한 75% 에탄올1 ml을 첨가하여 세척하였다. 세척액을 모두 제거해준 후DEPC water를 분주하여 pellet과 섞어준다. Total RNA량은 nano drop을 이용하여 측정하였으며, cDNA합성은 추출된 RNA (2 µg)와 Oligo (dT) 15 primer 1 µl를 섞어준 후nuclease free water (NW)을 첨가하여 5분(75℃) 반응한 다음 5분(4℃) 반응해준 후 5X reaction buffer, reverse transcriptase, MgCl2, polymerase chain reaction (PCR) nucleotide mix, NW, rnasin inhibitor을 첨가하여 5분(25℃), 60분(42℃), 15분(70℃), 10분(4℃) 반응시켜 제조하였다.

Reverse transcription-PCR (RT-PCR)

항염증 활성을 염증 매개 인자의 mRNA 발현으로 확인하기 위해 RAW 264.7 세포를 이용하여 RT-PCR로 측정하였다. 합성한 cDNA를 PCR PreMix와 primer sequences를 섞은 후 실험을 진행하였다. 실험에서 사용된 primer sequences는 Table 1과 같다. GAPDH는 2분(96℃), 10초(96℃), 30초(64℃), 1분(72℃), 10분(72℃)으로 30 cycles, iNOS는 2분(96℃), 10초(96℃), 30초(62℃), 1분(72℃), 10분(72℃)으로35 cycles, COX-2는 2분(96℃), 10초(94℃), 30초(51℃), 1분(72℃), 10분(72℃)으로 35 cycles을 실행하였다. 1.5%agarose gel에 1% midori green을 첨가하여 100 V에서30분 미만으로 전기 영동 한 후 밴드 확인을 위해 UV를 조사하였다.

Table 1 . Sequence of the primers used for RT-PCR.

GenePrimerSequence (5’ → 3’)
GAPDHsenseTGA AGG TCG GTG TGA ACG GAT TTG GC
Anti-senseCAT GTA GGC CAT GAG GTC CAC CAC
iNOSsenseAAT GGC AAC ATC AGG TCG GCC ATC ACT
Anti-senseGCT GTG TGT CAC AGA AGT CTC GAA CTC
COX-2senseGGA GAG ACT ATC AAG ATA GT
Anti-senseATG GTC AGT AGA CTT TTA CA


통계 처리

실험 결과에 대한 통계처리는 모든 실험을 3회 반복하였으며, Mean ± SD (Standard diviation)로 나타내었고, 실험결과 데이터는 ANOVA를 실시하여 각 시료에 대한 대조군과 얻은 실험 데이터에 대한 유의성을 post-hoc test를 통해 Tukey range test를 사용하여 95% 수준에서 유의성을 검증하여 나타내었다.

총 폴리페놀 함량

항산화 물질이라 알려진 Phenolic compound 및 flavonoids, vitamin, carotenoid 등은 식물체에 많이 함유되어져 있다고알려져 있으며, 특히 2차 대사산물인 phenolic compound는식물계에서 8,000여개의 구조를 가지고 있는 성분으로 알려져 있다[33]. Phenolic compound는 콜레스테롤, 항암, 항산화 등의 다양한 생리활성을 갖고 있어 대표적인 항산화 작용으로 생체내에서 free radical 반응이 발생하게 되면hydroxyl group에 의해 유리기들이 안정화되며 이로 인해 산화 억제 작용을 한다[34, 35].

애플망고 껍질의 총 폴리페놀 함량 측정 결과는 Tannic acid를 표준물질로 사용하여 추출물 100 g당 함유하고 있는tannic acid의 양(tannic acid equicalent; TAE)으로 환산하여 표시하였다. 결과값은 Table 2에 나타내었으며, 애플망고껍질의 열수 추출물은 65.25 ± 0.12 mg TAE/100 g이 나타났으며, 애플망고 껍질의 70% 에탄올 추출물은 100.13 ± 0.23 mg TAE/100 g의 폴리페놀 함량을 확인하였다.

Table 2 . Total polyphenol contents in Mangifera indica L. peel.

SampleTotal polyphenol (mg TAE/100 g)
AMPW65.25 ± 0.12***
AMPE100.13 ± 0.23***

Results are means ± SD from triplicate experiments. (*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, AMPW vs AMPE). AMPW, Apple mango peel extracted with distilled water at 100℃; AMPE, Apple mango peel extracted with 70% ethanol at room temperature.



전자공여능

체내에 hydroxyl radical (·OH), hydrogen peroxide (H2O2), superoxide radical (O2·) 등의 free radical이 존재할 경우 세포막, 단백질, DNA 등을 변성시키거나 파괴하여세포 기능의 장애를 유발한다. 전자공여능 측정은 비교적 안정한 free radical로 짙은 보라색인 DPPH를 사용하여ascorbic acid, glutathione, cysteine, butylated hydroxy anisole 등에 의해 환원되어져 노란색으로 변하는 원리를 이용하였다. 이는 항산화 활성 검증에 유용하게 사용되어지고있다고 알려져 있다[36, 37].

애플망고 껍질의 열수 및 70% 에탄올 추출물의 전자공여능을 측정한 결과, 농도가 증가함에 따라 애플망고 껍질 추출물의 전자공여능이 증가하는 것을 확인하였으며, 이는 1,000 µg/ml 농도에서 열수 추출물은 86.89%의 효과를 보였고, 70% 에탄올 추출물은 94.06%의 효과를 보여 대조군인vitamin C와 유의한 결과를 나타내었다(Fig. 1).


ABTS radical 소거능

Potassium persulfate에 의해 반응하여 생성되어진 ABTS free radical은 과일, 식물 등의 추출물 내의 항산화 물질에의해 시약의 청록색이 탈색되어지는 반응을 이용한 방법이다[38]. ABTS radical은 비극성 물질에만 반응하는 DPPH radical과 달리 극성 및 비극성 물질에 모두 반응하며, DPPH radical과 반응하지 않는 비극성 물질이 ABTS radical과는반응하여 소거되어진다고 알려져 있다[39, 40].

애플망고 껍질의 열수 및 70% 에탄올 추출물의 ABTS 라디칼 소거능을 측정한 결과, 농도 의존적으로 활성이 증가함을 확인하였으며, 1,000 µg/ml 농도에서 열수 추출물은80.62%의 소거능이 나타났고, 70% 에탄올 추출물은 98.66%의 소거능을 나타내었다. 이는 대조군인 vitamin C와 비교하였을 때 유의한 결과가 나타났음을 확인하였다(Fig. 2).


세포 생존율(MTT assay)

MTT는 미토콘드리아 내의 redoxase의 효소 작용으로 인해 살아있는 세포 내에서만 환원되어져 formazan을 형성하여 보라색으로 변하는데, 이를 유기용매 등의 용해액으로 용해시킨 후 흡광도를 이용하여 살아있는 세포의 수를 측정할수 있다[41].

애플망고 껍질의 열수 및 70% 에탄올 추출물을 대식세포인 RAW 264.7 세포에서의 MTT assay를 이용하여 세포 생존율을 측정하여 결과로 나타내었다. 애플망고 껍질의 열수 및 70% 에탄올 추출물은 500 µg/ml 이하의 농도에서 99% 이상의 세포 생존율이 나타났으며, 이후 세포 실험에서는 99% 이상의 생존율을 보이는 10, 50, 100, 500 µg/ml 농도에서 실험을 진행하였다(Fig. 3).


NO 생성 억제 활성

무기 유리체인 NO는 NO 합성 효소로 인해 L-arginine으로부터 생성되며 이는 신경 전달계, 세포독성, 혈관이완, 면역반응 등 여러 생리학적 작용에 관여하며 발현 정도에 따라 세포 기능 유지 역할을 수행하기도 하고 조직 손상 및 염증을 유발한다고 알려져 있다. 세포 내에 존재하는 NOS에의해 NO가 생성되어지는데, NOS 중 LPS와 같은 자극제에의해 발현된 iNOS는 많은 양의 NO를 생성하며 이로 인한세포독성은 종양 발생, 세포 돌연변이, 염증반응에 관여한다고 보고되어진다[42].

RAW 264.7 세포를 LPS로 활성시킨 후, 애플망고 껍질 열수 및 70% 에탄올 추출물 처리하여 NO의 생성을 측정하여결과로 나타내었다. LPS 단독 처리군은 LPS 무처리군에 비해 높은 NO 생성량이 나타났다. 결과적으로, 각 추출물을 농도별(10, 50, 100, 500 µg/ml)로 처리하였을 때 농도 의존적으로 NO 생성량이 감소하는 것을 확인하였다. 500 µg/ml농도에서 애플망고 껍질의 열수 추출물은 46%의 저해 효과가나타났고, 70% 에탄올 추출물은 40%의 저해 효과를 나타냈다(Fig. 4).


Western blot을 통한 iNOS 및 COX-2에 대한 단백질 발현억제 효과

염증 관련 인자인 NOS는 3가지의 isoform이 존재하는데이는 Type I, II, III로 나누어진다. Type I은 neuronal NOS, Type II는 endothelial NOS로 세포내에 항상 존재하고 있으며, Type III인 iNOS는 대식세포 등에서 사이토카인, LPS와 같은 내독소의 자극에 의해 발현되어 NO 생성을 촉진시켜 세포독성, 염증성 질병 등의 작용이 발생한다[43]. 아라키돈산이 prostaglandin으로 변화되는 것을 촉진하는 효소로서 COX가 알려져 있으며, 이는 COX-1, COX-2 두 가지형태가 존재한다. COX-1은 신체 내에서 항상성 유지 등에관여하며, COX-2는 면역반응 시 사이토카인에 의해 염증 부위에서 세포 내 발현이 증가하여 부종, 열, 통증 등의 염증반응을 유발시킨다[44]. 이러한 염증 관련 인자에 대한 억제효과를 확인하여 항염증 활성을 확인하고자 하였다.

애플망고 껍질의 열수 및 70% 에탄올 추출물에 대해 염증성 매개 인자인 iNOS 및 COX-2의 단백질 발현을 western blot을 통해 측정한 결과를 Figs. 5 and 6에 나타내었다. Housekeeping gene으로 β-actin을 사용하였으며, iNOS와COX-2의 단백질 발현량이 500 µg/ml 농도에서 열수 추출물은 각각 12%, 97%의 억제 효과를 나타내었고 70% 에탄올추출물은 각각 62%, 91%의 억제 효과를 나타내었다.


RT-PCR을 통한 iNOS 및 COX-2에 대한 mRNA 발현 억제 효과

생채 내의 NOS 효소는 촉매작용을 일으켜 L-arginine으로부터 염증반응의 매개체인 NO를 생성한다. 이렇게 생성된 NO는 과도하게 생성되었을 때 조직 파괴, 면역체계 이상등을 발생시킨다. 또한, NO는 COX-2라 불리는 2형 동위효소를 활성화시켜 염증성 매개 물질인 PGE2의 생성을 촉진시켜 조직 손상 등을 발생시킨다. 따라서 염증성 질환은 염증성 매개 물질들의 과도한 생성을 억제하는 것이 중요하다고 알려져 있다[45].

염증인자인 iNOS와 COX-2의 mRNA 발현 억제 효과를 측정하기 위해 RT-PCR을 이용하여 실험을 진행하였다. RAW 264.7 세포에 애플망고 껍질의 열수 및 70% 에탄올 추출물을 처리한 후 각 mRNA의 발현량을 측정한 결과는 Figs. 7 and 8에 나타내었다. LPS 단독 처리군과 LPS 무처리군의차이를 비교하였을 때 LPS 단독 처리군에서 mRNA 발현량이 증가함을 보였으며, iNOS 및 COX-2의 mRNA 발현량은500 µg/ml 농도에서 열수 추출물은 각각 3%, 33% 억제 효과를 나타내었고 70% 에탄올 추출물은 각각 29%, 36%의 억제 효과를 나타내었다.


본 연구에서는 폐기물로 버려지는 애플망고의 껍질에 관한 항산화 및 항염증 활성을 확인하여 새로운 천연 소재로서의 활용가능성에 대해 확인하고자 하였다. 지구 온난화로인해 국내의 기후가 변화하며 열대 과일의 재배가 늘어나고있는 추세로 특히, 애플망고가 가장 대표적으로 재배되어지고 있어 국내 소비자들의 수요가 증가하고 있다. 이로 인해과육은 많이 소비되지만 껍질은 폐기물로서 버려지고 있으며 이에 관한 연구는 미비한 실정이다. 본 연구 결과를 통해애플망고 껍질의 열수 및 70% 에탄올 추출물의 총 폴리페놀함량을 확인하였으며, 전자공여능, ABTS radical 소거능을통해 항산화 활성을 가졌음을 확인하였다. 또한, NO 생성 저해효과 뿐만 아니라 염증 매개 물질인 iNOS와 COX-2의 단백질 및 mRNA 발현에 관해 우수한 저해 효과가 나타나는것을 확인하여 항산화 및 항염증 관련 천연 소재로서 개발가능성이 있을 것으로 사료된다.

최근 국내 기후 변화로 인해 열대 과일 재배가 가능해지게 되었다. 특히 대표적으로 제주도에서 애플망고의 재배가활발히 이루어지고 있으며 이로 인해 소비자들의 수요가 증가하고 있다. 그러나 애플망고 과육을 제외한 껍질과 같은부산물은 활용도가 떨어져 폐기되고 있는 실정이다. 이에 본연구에서는 부산물로서 폐기되어지는 애플망고 껍질을 활용하기 위해 이를 이용하여 항산화 및 항염증 효과를 검증하고자 열수 및 70% 에탄올로 추출하여 실험을 진행하였다.먼저 애플망고 껍질의 열수 및 70% 에탄올 추출물의 총 폴리페놀 함량을 확인하였으며, 그 결과 66.08 ± 0.12 mg TAE/100 g, 100.13 ± 0.23 mg TAE/100 g의 함량을 나타내었다. 항산화 활성을 측정하기 위해 전자공여능과 2,2'-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS)라디칼 소거능을 측정하였다. 전자공여능 측정결과, 1,000 µg/ml 농도에서 열수 추출물은 86.89%가 나타났고, 70% 에탄올 추출물은 94.06%를 확인하였다. ABTS 라디칼 소거능을 측정 결과로 1,000 µg/ml 농도에서 열수 추출물은 80.62%를 나타내었고, 70% 에탄올 추출물은 98.66%의 소거능을 확인하였다. 이로 인해 애플망고 껍질 추출물의 항산화 활성은대조군인 비타민 C와 유사한 효과를 가진 것을 확인하였다.애플망고 껍질 추출물의 세포 생존율을 측정한 결과, 대식세포인 RAW 264.7 세포에서는 500 µg/ml 농도에서 99% 이상의 세포 생존율을 확인하였다. 이후 세포실험은 세포생존율이 99% 이상인 농도구간을 설정하여 진행하였다. 염증성 매개 물질로 알려진 nitric oxide (NO)에 대한 생성 억제 효과를 확인한 결과, 애플망고 껍질의 열수 추출물은 46%의 억제 효과가 나타났고, 70% 에탄올 추출물은 40%의 억제 효과를 확인하여 애플망고 추출물의 NO 생성량 저해 효과를가진 것을 확인하였다. 염증 매개 인자의 억제 효과를 확인하기 위해 RAW 264.7 세포를 이용하여 iNOS와 COX-2의단백질 및 mRNA 발현량을 측정하였다. 그 결과, LPS 단독처리군에 비해 애플망고 껍질 추출물을 처리하였을 때 iNOS와 COX-2의 단백질 발현량은 최종 농도인 500 µg/ml에서 열수 추출물은 12%, 97% 억제하는 것을 확인하였고, 70% 에탄올 추출물은 62%, 91% 억제하는 것을 확인하였다. 또한LPS 단독 처리군에 비해 iNOS와 COX-2의 mRNA 발현량결과, 500 µg/ml 농도에서 열수 추출물은 3%, 33%의 억제효과를 확인하였고, 70% 에탄올 추출물은 29%, 36%의 억제효과가 나타나는 것을 확인하였다. 본 연구 결과들을 토대로애플망고 껍질이 항산화 및 항염증 활성을 갖고 있는 것을검증하여 천연 소재로서의 활용 가치가 높을 것으로 사료된다.

The authors have no financial conflicts of interest to declare.

  1. Jung DH, Shin JH, Cho YY, Son JE. 2015. Development of a twovariable spatial leaf photosynthetic model of irwin mango grown in greenhouse. J. Bio-Env. Con. 24: 161-166.
    CrossRef
  2. An MR, Keum YS, Lee SK. 2015. Comparative analysis of volatile flavor compounds in Taiwan apple mango and Philippines Carabao Mango. Korean J. Food Sci. Technol. 47: 191-197.
    CrossRef
  3. Naef R, Velluz A, Jaquier A. 2006. The perfume of carabao mangoes (Mangifera indica L.): Identification of uncommon unsaturated fatty acid esters in the SPME of the intact fruit. Eur. Food Res. Technol. 222: 554-558.
    CrossRef
  4. Ji ST, Youm JW, Yoo JY. 2018. A feasibility study on the cultivation of tropical fruit in Korea: Focused on Mango. JKAIS 19: 252-263.
  5. Navarro M, Arnaez E, Moreira I, Quesada S, Azofeifa G, Wilhelm K, et al. 2019. Polyphenolic characterization, antioxidant, and cytotoxic activities of Mangifera indica cultivars from Costa Rica. Foods 8: 384.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  6. Lauricella M, Lo Galbo V, Cernigliaro C, Maggio A, Palumbo Piccionello A, Calvaruso G, et al. 2019. The anti-cancer effect of Mangifera indica L. peel extract is associated to γH2AX-mediated apoptosis in colon cancer cells. Antioxidants (Basel) 8: 422.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  7. Lim K, Cabajar AA, Lobarbio C, Taboada EB, Lacks DJ. 2019. Extraction of bioactive compounds from mango (Mangifera indica L. var. Carabao) seed kernel with ethanol-water binary solvent systems. J. Food Sci. Technol. 56: 2536-2544.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  8. Alañón ME, Palomo I, Rodríguez L, Fuentes E, Arráez-Román D, Segura-Carretero A. 2019. Antiplatelet activity of natural bioactive extracts from Mango (Mangifera Indica L. ) and its by-products. Antioxidants (Basel) 8: 517.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  9. Dhananjaya BL, Shivalingaiah S. 2016. The anti-inflammatory activity of standard aqueous stem bark extract of Mangifera indica L. as evident in inhibition of Group IA sPLA2. An. Acad. Bras. Cienc. 88: 197-209.
    Pubmed CrossRef
  10. Kim MK. 2017. Comparison of antioxidant and antimicrobial activities of pulp and peel extracts of Mango. J. Invest. Cosmetol. 13: 113-118.
    CrossRef
  11. Kim HK. 2018. The effects of fruit and vegetable bark extract on learning ability and memory improvement. JCCT 4: 261-267.
  12. Jung ES. 2007. Antioxidant and antibacterial activity of extracts from Mangifera indica. Sunchon National University, Sunchun, Korea.
  13. Sivakumar D, Jiang Y, Yahia EM. 2011. Maintaining mango (Mangifera indica L.) fruit quality during the export chain. Food Res. Int. 44: 1254-1263.
    CrossRef
  14. Lee JY, Yoo DH, Joo DH, Kim SR, Jo HS, Joo SH, et al. 2017. Antiinflammatory effects of Amelanchier asiatica fruits ethanol extract. J. Soc. Cosmet. Scientists Korea 43: 19-26.
    CrossRef
  15. Lee SH, Suh SJ, Lee KH, Yang JB, Choi SU, Park SS. 2013. Antiinflammatory effect of peel extracts from citrus fruits. J. Food Hyg. Saf. 28: 342-348.
    CrossRef
  16. Jeong DH, Kim KBWR, Kang BK, Jung SA, Kim HJ, Jeong HY, et al. 2012. Anti-inflammatory activity of the water extract of Sargassum fulvellum. KSBB J. 27: 325-329.
    CrossRef
  17. Jung YS, Eun CS, Jung YT, Kim HJ, Yu MH. 2013. Anti-inflammatory effects of Picrasma Quassioides (D.DON) BENN leaves extracts. J. Life Sci. 23: 629-636.
    CrossRef
  18. RodriguezVita J, Lawrence T. 2010. The resolution of inflammation and cancer. Cytokine Growth Fact. Rev. 21: 61-65.
    Pubmed CrossRef
  19. Lee JY, Yoo DH, Jeong YS, Joo SH, Chae JW. 2018. Verification of anti-inflammatory activities of the ethanol extracts of Glechoma hederacea var. longituba in RAW264.7 cells. J. Life Sci. 28: 429-434.
  20. Roh KB, Lee JA, Park JH, Jung KS, Jung ES, Park DH. 2017. Antiinflammatory and anti-allergic effects of Gnaphalium affine extract. J. Soc. Cosmet. Sci. Korea 43: 103-114.
  21. Knowles RG, Moncada S. 1994. Nitric oxide synthases in mammals. Biochem. J. 298: 249-258.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  22. Nathan C. 1997. Inducible nitric oxide synthase: what difference does it make? J. Clin. Invest. 100: 2417-2423.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  23. Xue Q, Yan Y, Zhang R, Xiong H. 2018. Regulation of iNOS on immune cells and its role in diseases. Int. J. Mol. Sci. 19: 3805.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  24. Kim HJ, Lee DJ, Ku JJ, Choi K, Park GW, Kang SH, et al. 2013. Antiinflammatory effect of extracts from folk plants in Ulleung Island. Korean J. Plant Res. 26: 169-177.
    CrossRef
  25. Kim JY, Jung KS, Jeong HG. 2004. Suppressive effects of the kahweol and cafestol on cyclooxygenase-2 expression in macrophages. FEBS Lett. 569: 321-326.
    Pubmed CrossRef
  26. Kwon YB, Yoo BS, Kim DS, Moon SJ, Yoon MS, Park SN. 2010. Anti inflammatory activity of Viburnum dilatatum Thunb. extract as cosmetic ingredient. J. Soc. Cosmet. Sci. Korea 36: 183-191.
  27. Lee SH, Suh SJ, Lee KH, Yang JB, Choi SU, Park SS. 2013. Anti-Inflammatory effect of peel extracts from citrus fruits. J. Food Hyg. Saf. 28: 342-348.
    CrossRef
  28. Singleton VL, Orthofer R, Lamuela-Raventos RM. 1999. Analysis of total phenols and other oxidation substrates and antioxidants by means of Folin-Ciocalteu reagent. Methods Enzymol. 299: 152-178.
    CrossRef
  29. Blois MS. 1958. Antioxidant determinations by the use or a stable free radical. Nature 181: 1199-200.
    CrossRef
  30. Roberta R, Nicoletta P, Anna P, Ananth P, Min Y, Catherine RE. 1999. Antioxidant acitivity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay. Free Rad. Biol. Med. 26: 1231-1237.
    CrossRef
  31. Jeong DH, Kim KBWR, Kang BK, Jung SA, Kim HJ, Jeong HY, et al. 2012. Anti-inflammatory activity of the water extract of Sargassum fulvellum. KSBB J. 27: 325-329.
    CrossRef
  32. Green LC, Wagner DA, Glogowski J, Skipper PL, Wishnok JS, Tannenbaum SR. 1982. Analysis of nitrate, nitrite, and [15N] nitrate in biological fluids. Anal. Biochem. 126: 131-138.
    CrossRef
  33. Yoo YC, Lee GW, Cho YH. 2016. Antioxidant and anti-inflammatory effects of extracts from the flowers of Weigela subsessilis on RAW 264.7 macrophages. J. Life Sci. 26: 338-345.
    CrossRef
  34. Lee SO, Lee HJ, Yu MH, Im HG, Lee IS. 2005. Total polyphenol contents and antioxidant activities of methanol extracts from vegetables produced in Ullung Island. Korea J. Food Sci. Technol. 37: 233-240.
  35. Jeong HJ, Park SB, Kim SA, Kim HK. 2007. Total polyphenol content and antioxidative activity of wild grape (Vitis coignetiae) extracts depending on ethanol concentrations. J. Korean Soc. Food Sci. Nutr. 36: 1491-1496.
    CrossRef
  36. Slater TF. 1984. Free-radical mechanisms in tissue injury. Biochem J. 222: 1-15.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  37. Yu MH, Im HG, Lee HJ, Ji YJ, Lee IS. 2006. Components and their antioxidative activities of methanol extracts from sarcocarp and seed of Zizyphus jujuba var. inermis Rehder. Korean J. Sci. Technol. 38: 128-134.
  38. Jung SB. 2018. A study of the antioxidative activities of purple corn husk extracts as cosmetic ingredient. Silla University, Busan, Korea.
  39. Jang DY. 2020. A Study on the effectiveness evaluation of Rhus javanica L. fruit extracts and the application of cosmetics. Mokwon University, Deajeon, Korea.
  40. Jo HJ, Kim JW, Yoon JA, Kim KI, Chung KH, Song BC, et al. 2014. Antioxidant activities of Amaranth (Amaranthus spp. L.) flower extracts. Korean J. Food Nutr. 27: 175-182.
    CrossRef
  41. Kim YE, Yang JW, Lee CH, Kwon EK. 2009. ABTS radical scavenging and anti-tumor effects of Tricholoma matsutake sing. (Pine Mushroom). J. Korean Soc. Food Sci. Nutr. 38: 555-560.
    CrossRef
  42. Yoon WJ, Lee JA, Kim KN, Kim JY, Park SY. 2007. In vitro antiinflammatory activity of the Artemisia fukudo extracts in murine macrophage RAW264.7 cells. Korean J. Food Sci. Technol. 39: 464-469.
  43. Cossenza M, Socodato R, Portugal CC, Domith IC, Gladulich LF, Encarnação TG, et al. 2014. Nitric oxide in the nervous system: biochemical, developmental, and neurobiological aspects. Vitam. Horm. 96: 79-125.
    Pubmed CrossRef
  44. Golden BD, Abramson SB. 1999. Selective cyclooxygenase-2 inhibitor. Rheum. Dis. Clin. N. Am. 25: 359-378.
    CrossRef
  45. Kang CH, Koo JR, So JS. 2012. Inhibitory Effects of Aralia cordata thunb extracts on nitric oxide synthesis in RAW264.7 macrophage cells. Korean J. Food Sci. Technol. 44: 621-627.
    CrossRef

Starts of Metrics

Share this article on :

Most Searched Keywords ?

What is Most Searched Keywords?

  • It is most registrated keyword in articles at this journal during for 2 years.