Fermentation Microbiology (FM) | Strain Isolation and Improvement
Microbiol. Biotechnol. Lett. 2021; 49(4): 552-558
https://doi.org/10.48022/mbl.2106.06004
Chae-Yun Moon and Moon-Soo Heo*
Department of Aquatic Biomedical Sciences, Jeju National University, Jeju 63243, Republic of Korea
Correspondence to :
MoonSoo Heo, msheo@jejunu.ac.kr
Traditional foods are manufactured according to the characteristics of each region for the nations of the world. Korea has mainly farmed, and seasonings have developed around rice and vegetables. In fermented foods, lactic acid bacteria such as Lactobacillus sp. and Pediococcus sp. and Bacillus sp. were isolated and identified from fermented foods. In this study, lactic acid bacteria were isolated and identified from commercially available traditional Korean fermented foods, and candidate strains were selected through antibacterial activity tests on human and fish disease bacteria. Thereafter, the final strain was selected by examining the resistance to simulated gastric and intestinal fluids, and hemolysis. The three (M1, K1, C13) final selected latic acid bacteria were miced with prebiotics and the antibacterial activity of synbiotics was evaluated. As for the fist antibacterial activity result, C13 showed high antibacterial acitivity in human diseases and fish diseases. Then, M1, K1 and C13, which did not produce β-haemolysis and were resistant to simulated gastric and intestinal fluids, were subjected to the second antibacterial activity of synbiotics. When the three prebiotics (FOS, GOS, Inulin) and probiotics (M1, K1, C13) were mixed, the antibacterial activity was increased or inhibited. Based on the 16S rRNA gene sequencing results, K1 and M1 were analyzed as Bacillus tequiensis 99.72%, Bacillus subtilis 99.65%, Bacillus inaquosorum 99.72%, Bacillus cabrialesii 99.72%, Bacillus stercoris 99.58%, Bacillus spizizenii 99.58%, Bacillus halotolerans 99.58%, and Bacillus mojavensis 99.51%. And C13 was analyzed as Bacillus velezensis 99.71%, Bacillus nematocida 99.36%, Bacillus amyloliquefaciens 99.44%, Bacillus atrophaeus 99.22%, and Bacillus nakamurai 99.44%.
Keywords: Synbiotics, probiotics, prebiotics, phylogenetic analysis, 16S rDNA, antibacterial activity
전통식품은 자신의 국토의 삶과 기후, 풍토 및 지역 특산산물에 따라 식습관과 식생활 등에 따라 만들어진다.
한국은 오랫동안 농경을 중심으로 먹거리를 해오며 쌀과함께 채소류를 중심으로 조미료가 발달되었고, 염절임 기법을 통해 발효식품을 만들었다[1]. 대표적인 예로 김치가 있으며, 수산식품으로는 어패류를 소금에 절여 발효하고 숙성시켜 젓갈로 만들어 식용해왔다[2]. 젓갈은 단백질과 칼슘, 지방이 풍부하며 호염성 또는 염분성 미생물에 의해 발효되어 김치의 주원료 중 하나로 쓰이기도 한다[3]. 이러한 발효식품에서 주로 찾아볼 수 있는 종은
Prebiotics는 특정 식품 속에 있는 섬유질 성분으로 장내유익 세균의 성장을 도와주며 장 안의 유해세균과 유익세균의 균형을 유지시켜준다[6]. 또한 면역계의 biomarker와 활동을 조절하는데 관련되어 장내 세균의 불균형 상태인 ‘dysbiosis’ 및 장내 염증 질환을 줄이는데 도움이 된다. Synbiotics는 이러한 probiotics와 prebiotics를 혼합한 것으로 단일로 사용했을 때보다 높은 시너지 효과를 발생한다.이는 유산균의 생존능력을 강화시켜주고 특정된 건강에 이로운 효과를 나타낸다고 알려져 있다[7]. 돼지의 경우 영양소 소화 개선, 유해 가스 배출을 감소시키며 유해세균의 감염을 방지하며[8], 육계의 경우 사료 전환율과 체중이 증가하는 신바이오틱스의 긍정적 효과가 입증되었다[9]. 또한 양식 산업에서의 신바이오틱스는 수생 생물의 질병을 저항과소화율을 증진시키는데 도움을 준다고 알려져 있으며[10] 지속적인 연구가 필요하다.
본 연구에서는 시장에서 시판되고 있는 한국전통발효식품을 통해 유산균을 분리 및 동정하였고, 유해세균에 대한 항균능력이 우수한 균주를 선별하였다. 그리고 우수 후보 균주의 인공위액 및 담즙액에 대한 내성과 용혈능 등을 검토하여 최종 균주를 선별하였다. 최종 선별된 유산균은 3종의prebiotics와 혼합한 synbiotics로서의 항균활성 능력을 평가하였다. 이는 추후 양식 산업에서 일어나는 질병에 대한 예방 및 치료를 위한 응용 실험을 하는데 기초 자료로 사용될것이라 생각된다.
본 실험에 사용 된 한국전통발효식품은 제주도 제주시와서귀포시에서 판매되고 있는 김치, 멸치 젓갈, 명란 젓갈, 갈치 젓갈, 창란 젓갈을 구매하여 아이스박스에 담아 -4℃를유지시켜 운송시킨 후 실험에 사용하기 전까지 -80℃에서 보관하였다.
한국전통발효식품에 존재하는 유산균을 분리하기 위해 멸균 된 가위로 김치(K)와 젓갈류(M; 멸치 젓갈, R; 명란 젓갈, K; 갈치 젓갈, C; 창란 젓갈)를 잘게 잘라내어 1g만 떠내어멸균된 0.85% 생리식염수에 담아 단계별(10-3−10-5)로 희석시켜 MRS agar (MRS, Difco., USA)에 각각 100 μl씩 도말하였다. 배지 상에서 자라난 균은 단일 colony로 순수 분리하여 같은 배지 상에 48시간 동안 재 배양시킨 후 25%(v/v) glycerol에 현탁시켜 -80℃에서 보관하였다.
항균 활성 탐색은 미생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures, KCTC)와 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에서 인체유해세균과 어류질병세균을 각각 분양 받아 사용하였고(Table 1), Wild type은 인체의 피부를 통해 분리하였다. 그리고 25%glycerol에 현탁 시켜 사용하기 전까지 -80℃에서 보관하였다. 유해 세균은 알맞은 배지 안에서 배양되었고, 한국전통식품에서 분리한 균주는 MRS에 접종시켜 35℃에서 48시간동안 배양하였다. 각각 배양한 균주는 1.5 ml tube 안에 넣어 14240 ×g로 원심 분리한 뒤 상등액과 균체로 나누어 분리하였다. 상등액은 0.45 µm syringe filter (Whatman, UK)를 통해 여과시켰고 균체는 0.85% 생리식염수 50 µ를넣어 풀어냈다. 다음 여과 된 상등액과 현탁 된 균체는 각각 멸균 된 8 mm paper disc (Advantec, Japan)에 50 ul씩 분주하고 35℃에서 24시간동안 건조시켰다. 병원균은MacFarland turbidity 0.4로 조절한 후 Muller Hinton Agar (MHA, Difco, USA)에 도말하여 각각의 배양 온도에맞추어 48시간 동안 형성 된 억제환의 크기를 측정하였다.
Table 1 . List of strains used of antibacterial experiment.
Information | Strain | No. | Medium | Temperature (℃) | Type |
---|---|---|---|---|---|
Fish pathogen | KCTC3657 | 1.5BHIA | 25 | - | |
KCTC3651 | 1.5BHIA | 25 | - | ||
KCTC12267 | 1.5BHIA | 25 | - | ||
Human pathogen | KCTC1682 | TSA | 37 | - | |
KCCM11211 | NA | 26 | - | ||
KCCM40105 | BHIA | 37 | - | ||
- | BHIA | 37 | Wild type |
유산균과 prebiotics의 혼합(synbiotics)은 용혈성과 인공위액 및 담즙액에서 안전성을 가진 균주를 선별하여 실험에사용되었다. Prebiotics는 Galactooligosaccharides (GOS, Carbosynth., UK), Fructooligosaccharide (FOS, Carbosynth., UK) 및 Inulin from chicory (Inulin, Carbosynth)을 각각1−5%로 농도를 조정하여 사용하였다. 다음 0.45 µm syringe filter (Whatman)를 통해 여과시키고 유산균은 105−107 cfu/g-1으로 맞추어 동일하게 혼합한 후 균체만 획득하여 위와 같은 실험방법으로 진행되었다.
항균활성에서 우수한 결과를 나타낸 균주를 선별하여 인공 위액 및 담즙액 내성을 측정하였다. 인공 위액은 Brinques등(2010), 인공 담즙액은 Charteris 등(1998)의 방법을 이용하였다. 인공 위액은 제조된 0.5% 멸균 생리식염수와 3.0 g/l의농도로 제조된 pepsin (Sigma-Aldrich P7000, pH 2.0)을 이용하였다. 인공 담즙액은 0.5% 멸균된 생리식염수와 1 g/l pancreatin (Sigma-Aldrich P-1500)을 혼합시킨 뒤 4.5%bile salts (Oxoid, UK)를 첨가하여 최종 pH를 8.0으로 조정하여 사용하였다. 준비된 위액과 장액은 10 ml 코니칼튜브에 담아 유산균 1 ml cell suspension을 부드럽게 코니칼튜브에 넣어 잘 혼합시켜 주었다. 다음 37℃에서 0, 30, 60, 90, 120분에서 각각 배양시켰다. 시간 별로 배양된 혼합물은MRS agar plate에 100 ul씩 분주하여 35℃에서 24시간 배양한 뒤 아래 식을 적용하여 생존율을 체크하였다.
생존율(%) = [(생존 균 수(CFU/g)/초기 균 수(CFU/g)] × 100
인공 위액과 담즙액에서 내성 결과가 우수했던 균주를 선별하여 5% (w/v) human blood 평판 배지에 접종하여 35℃에서 48시간 배양하였다. 그리고 배지가 어두워지고 녹색을띄면 α-haemolysis, 콜로니 주변으로 적혈구가 완벽하게 용해되면 β-haemolysis, 용혈성을 띄지 않으면 γ-haemolysis로각각 검토하였다.
최종 선별된 균주는 Genomic DNA Extraction Kit (Bioneer, Korea)로 DNA를 추출하였다. 다음 genomic DNA 1 ul와 27F/1492R universal primer는 각각 0.5 μM primer와 DNA polymerase, reaction buffer, dNTPs가 포함된 20 ul PreMix (Bioneer)를 사용하여 PCR을 수행하였다.
PCR 반응 조건은 Intial denaturation (95℃, 2분), Denaturation (95℃, 30초), Annealing (55℃, 30초), Extension (72℃, 30초)으로 총 30 cycle로 수행하고 마지막으로 다시 한번 Extension (72℃, 5분) 하였다. 증폭 된 PCR산물은 Red safe (Intron, USA)가 첨가된 1% agarose (Promega Co., USA) gel로 전기영동하여 확인하였다. 다음AccuprepTM PCR purification Kit (Bioneer)를 사용하여PCR 산물에 남아있는 primers, nucleotides, polymerase, salts를 제거 및 정제하고 elution buffer (10 mM Tris-Cl, pH 8.5) 30 μl로 용출하였다. PCR products의 염기서열의분석은 (주)솔젠트 (Korea)에 의뢰하여 결과를 얻었다. 분석된 염기서열은 EzTaxone (http://eztaxon-e.ezbiocloud.net/)을 이용하여 homology를 확인하였다. 다음 ClustalX로 multiple alignment를 수행한 뒤 MEGA 6.0로 계통도(phylogenetic tree)를 작성하였다.
한국전통식품으로 분리된 유산균의 항균 활성 탐색 결과, C13은 인체유해세균
Table 2 . Antibacterial activity of LAB isolated from Korean traditional food.
Isolated strain | Diameter of inhibition zone (mm) | |||||||||||||
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Pathogenic bacteria | ||||||||||||||
Supernatant | Pellet | Supernatant | Pellet | Supernatant | Pellet | Supernatant | Pellet | Supernatant | Pellet | Supernatant | Pellet | Supernatant | Pellet | |
M1 | - | 11 | - | - | - | - | - | - | - | 24 | - | 21 | - | - |
M2 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | 27 | - | - |
M3 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | 26 | - | - |
R1 | - | - | - | + | - | - | - | - | - | 18 | - | 25 | - | - |
R2 | - | - | - | + | - | - | - | - | - | + | - | 25 | - | - |
R3 | - | - | - | + | - | - | - | - | - | + | - | 25 | - | - |
R7 | - | 11 | - | + | - | - | - | - | - | 20 | - | 18 | - | - |
K1 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | 20 | - | 20 | - | 14 |
K5 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | + | - | 18 | - | - |
K6 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | + | - | - | - | - |
C2 | - | 13.5 | - | - | - | + | - | - | - | - | - | 21 | - | + |
C3 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | + | - | - |
C4 | - | - | - | - | - | + | - | - | - | 20 | - | 16 | - | - |
C5 | - | - | - | + | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
C6 | - | - | - | + | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
C7 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | 20 | - | + | - | - |
C8 | - | 16 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | 34 | - | - |
C9 | - | 12 | - | - | - | - | - | - | - | 9 | - | - | - | - |
C10 | - | 11 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
C12 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | + | - | - |
C13 | - | 11 | - | - | - | - | - | 12 | - | 22 | - | 26 | - | - |
C14 | - | 14 | - | - | - | 11 | - | - | - | 19 | - | + | - | 20 |
C15 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | 14 | - | + | - | - |
C16 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | + | - | 21 | - | - |
유산균은 일반적인 식품을 제조하는데 유통 기한을 늘리기 위한 화학적 물질을 대신하여 bacteriocin과 같은 천연 생체 활성 peptide로서 식품 부패와 병원균을 예방하고 품질유지를 도모한다[13]. 인체같은 경우 구강에 700종 이상의세균이 서식[14−16]하고 있는데 이들의 생태계 불균형을 막기 위해 probiotics는 유용하게 사용될 수 있다고 알려져 있다. 양식업은 수생 생물의 질병 치료 및 예방에 있어 오랜 시간 동안 항생제를 사용해 왔다. 그 결과, 염색체의 돌연변이에 의해 plasmid의 매개 저항성을 지닌 내성균주가 증가하게 되었고[17], 이를 대체할만한 안전요법으로 probiotics를이용한 넙치[18], 돌돔[19] 및 가자미[20] 등의 여러 수생 생물에게 적용하였다. 그 결과 유산균의 이용은 성장률 증진및 비특이적 면역을 활성화시키는 등 유익한 결과를 입증해왔다. 이러한 probiotics의 대표 항균 물질은 bacteriocin으로2차 대사산물이 아닌 단백질 또는 단백질 복합체로 살균 활성을 가지며[21, 22], 항균 범위가 매우 넓고 유해 세균의 억제 및 사멸 시키는데 효과적으로 알려져 있다[23, 24].
Synbiotics의 항균 활성은 기존의 유산균에 대한 저해환크기가 측정되는 균주를 선별한 뒤, 인공 위액과 담즙액 및용혈성에서 안정성을 보인 균주로 실험이 진행되었다. 우수 후보 균주로 선발된 M1, K1과 C13은 3종의 prebiotics를 농도 별로 혼합하고 어류질병세균을 타겟으로 실험을 진행한결과,
Table 3 . Antibacterial activity of synbiotics (probiotics + prebiotics) treated with different concentrations.
Pathogenic bacteria | Diameter of inhibition zone (mm) | ||||||||||||||
Prebiotics | |||||||||||||||
FOS | GOS | Inuline | |||||||||||||
Isolated strain | 1% | 2% | 3% | 4% | 5% | 1% | 2% | 3% | 4% | 5% | 1% | 2% | 3% | 4% | 5% |
M1 | 23 | 22 | 24 | 22 | 21 | 20 | 20 | 20 | 23 | 22 | 22 | 22 | 23 | 23 | 23 |
K1 | 23 | 22 | 24 | 22 | 24 | 21 | 20 | 23 | 23 | 22 | 22 | 24 | 25 | 24 | 23 |
C13 | 23 | 22 | 22 | 23 | 22 | 22 | 23 | 23 | 22 | 25 | 27 | 23 | 23 | 25 | 24 |
Pathogenic bacteria | Diameter of inhibition zone (mm) | ||||||||||||||
Prebiotics | |||||||||||||||
FOS | GOS | Inuline | |||||||||||||
Isolated strain | 1% | 2% | 3% | 4% | 5% | 1% | 2% | 3% | 4% | 5% | 1% | 2% | 3% | 4% | 5% |
M1 | 21 | 20 | 23 | 21 | 23 | 20 | 19 | 18 | 20 | 20 | 21 | 22 | 22 | 23 | 21 |
K1 | 20 | 21 | 17 | 21 | 19 | 15 | 18 | 18 | 18 | 20 | 20 | 19 | 21 | 21 | 18 |
C13 | + | + | + | + | - | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
인공 위액과 담즙액 결과, 30분 뒤에는 C16과 C15가 가장높은 생존율을 보였으나, 60분 뒤 내성을 잃는 것을 확인하였다. 120분 뒤 C13이 71.0 ± 11.9%로 가장 높은 생존율을 보였고 다음 K1이 55.4 ± 5.9%, R3 42.8 ± 7.5 그리고 M1이16.4 ± 1.8 순으로 인공 위액의 내성을 나타내었다. 나머지균주는 5% 미만 또는 인공 위액에서 생존하지 못했다. 인공담즙액에서는 최종적으로 가장 생존율이 높았던 균주는 C13으로 48.9 ± 2.9%을 보였고, 다음 C15 45.1 ± 13.3%, C16 40.5 ± 7.0%, C7 36.5 ± 1.4%, R1 26.2 ± 3.9%, M1 23.7 ± 3.7%및 K1 20.5 ± 3.9% 순으로 나타났다(Table 4). 그 외 나머지는 3% 미만의 생존율을 보였다. 몇몇의 균주는 인공 위액에서 생존하지 못했으나 인공 담즙액에서는 생존하는 것을 관찰할 수 있었다. 숙주 체내 안에서의 인공위액과 담즙액 내성은 probiotics로서의 필수 요건으로 알려져 있다. 용혈성결과에서는 K1, C8, C13 및 C15가 γ-haemolysis을 보였고, M1, R2, R3와 R4는 α-haemolysis로 나타났고, 나머지는 β-haemolysis를 생산하였다. 결과적으로 β-haemolysis를 생산하지 않고 인공위액과 담즙액의 내성을 지닌 M1, K1 및 C13이 probiotics로 이용할 수 있다 판단되었다.
Table 4 . Simulated gastric juice and intestinal juice tolerance and hemolytic test of LAB isolated from Korean traditional food.
Isolated strain | Survival (%) | Haemolysis | |||||||
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Gastric juice | Intestinal juice | ||||||||
30 min | 60 min | 90 min | 120 min | 30 min | 60 min | 90 min | 120 min | ||
M1 | 17.6 ± 2.2 | 15.5 ± 2.3 | 14.4 ± 3.6 | 16.1 ± 1.8 | 29.0 ± 7.3 | 50.7 ± 8.1 | 36.0 ± 9.0 | 23.7 ± 3.2 | α |
M2 | 0.5 ± 0.1 | ND | ND | ND | 1.0 ± 0.2 | 0.3 ± 0.1 | ND | ND | β |
R1 | 3.9 ± 0.8 | 3.3 ± 0.3 | 2.9 ± 0.6 | 1.6 ± 0.9 | 52.2 ± 1.7 | 40.6 ± 0.6 | 26.7 ± 6.7 | 26.2 ± 3.9 | β |
R2 | 34.1 ± 7.7 | 29.1 ± 3.9 | 3.8 ± 1.3 | 5.2 ± 0.7 | 11.4 ± 0.7 | 5.8 ± 0.6 | 4.0 ± 0.4 | 1.8 ± 0.7 | α |
R3 | 28.8 ± 3.5 | 41.6 ± 1.4 | 38.7 ± 2.4 | 42.8 ± 7.5 | 9.5 ± 1.3 | 3.9 ± 1.1 | 3.4 ± .5 | 2.1 ± 0.4 | α |
R4 | ND | ND | ND | ND | 0.9 ± 0.5 | 0.5 ± .5 | 0.3 ± 0.2 | 0.1 ± 0.2 | α |
K1 | 59.8 ± 2.6 | 47.2 ± 10.1 | 50.0 ± 8.3 | 52.0 ± 8.0 | 55.4 ± 5.9 | 41.4 ± 2.4 | 40.1 ± 6.6 | 20.5 ± 3.9 | γ |
K2 | ND | ND | ND | ND | 4.1 ± 1.8 | 3.8 ± 1.3 | 2.9 ± 1.0 | 3.0 ± 0.8 | β |
C7 | 26.9 ± 7.8 | 23.7 ± 7.5 | ND | ND | 53.3 ± 4.7 | 1.2 ± 0.2 | 40.6 ± 7.2 | 36.5 ± 1.4 | β |
C8 | ND | ND | ND | ND | ND | ND | ND | ND | γ |
C13 | 30.9 ± 4.1 | 33.1 ± 6.8 | 31.6 ± 3.4 | 23.8 ± 6.5 | 71.0 ± 11.9 | 92.3 ± 6.3 | 36.9 ± 4.0 | 48.9 ± 2.9 | γ |
C15 | 83.0 ± 20.2 | ND | ND | ND | 54.0 ± 18.1 | 55.9 ± 14.7 | 37.5 ± 12.7 | 45.1 ± 13.3 | γ |
C16 | 133.3 ± 22.0 | ND | ND | ND | 65.3 ± 3.0 | 50.2 ± 6.0 | 47.0 ± 5.9 | 40.5 ± 7.0 | β |
*ND: No data.
Probiotics로서의 연구할 수 있는 최종 균주 3종은 16S ribosomal RNA PCR로 증폭하여 염기 서열을 얻었다. 다음EZbiocloud을 통해 분석한 결과, K1과 M1은
세계 각국의 민족은 자신의 국토의 삶과 기후 풍토, 지역특산 산물과 식습관 및 식생활 등에 따라 색다른 전통식품이 만들어 진다. 한국은 오랫동안 농경을 중심으로 먹거리를해오며 쌀과 함께 곁들일 채소류를 중심으로 조미료가 발달되었고, 염절임 기법을 통해 발효식품을 만들었다. 이러한 발효식품에서 주로 찾아볼 수 있는 종은
This work was supported by the research grant of Jeju National University in 2021.
The authors have no financial conflict of interest to declare.
Chae-Yun Moon, Hong-Ju Son, and Moon-Soo Heo
Microbiol. Biotechnol. Lett. 2022; 50(3): 347-353 https://doi.org/10.48022/mbl.2206.06010Chae-Yun Moon , Jun-Cheol Ko , Min-Seon Kim and Moon-Soo Heo
Microbiol. Biotechnol. Lett. 2020; 48(1): 57-63 https://doi.org/10.4014/mbl.1907.07013Soo-Jin Lim , Sung-Sik Jang and Dae-Kyung Kang
Microbiol. Biotechnol. Lett. 2007; 35(2): 98-103 https://doi.org/10.4014/mbl.2007.35.2.98