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Microbiology and Biotechnology Letters

보문(Article)

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Molecular and Cellular Microbiology (MCM)  |  Microbial Genetics, Physiology and Metabolism

Microbiol. Biotechnol. Lett. 2021; 49(1): 111-119

https://doi.org/10.48022/mbl.2011.11005

Received: November 19, 2020; Accepted: December 7, 2020

아욱 잎에서 분리한 Bacillus velezensis MV2의 유전체 염기서열 분석과 항균활성능 연구

Complete Genome Sequence and Antimicrobial Activities of Bacillus velezensis MV2 Isolated from a Malva verticillate Leaf

Hyeonju Lee1†, Eunhye Jo1†, Jihye Kim1, Keumok Moon1, Min Ji Kim2, Jae-Ho Shin2, and Jaeho Cha1*

These authors contributed equally to this work.

1Department of Microbiology, College of Natural Sciences, Pusan National University, Busan 46241, Republic of Korea 2School of Applied Biosciences, College of Agriculture and Life Sciences, Kyungpook National University, Daegu 41566, Republic of Korea

Correspondence to :
Jaeho Cha,
jhcha@pusan.ac.kr

식물생장촉진 근권세균(Plant Growth Promoting Rhizobacteria, PGPR)은 식물 뿌리 주변의 토양에 생육하면서 식물의 생장을 촉진한다고 잘 알려져 있다[1]. 유도 저항성(induced systemic resistance)을 촉진시켜 식물 자체의 방어 기작을 유도해 외부 환경적 스트레스와 병원균으로부터 식물을 보호하기도 한다. 이들은 식물 뿌리 주변에 공생하면서 식물 질병을 유발하는 병원미생물을 저해하기 때문에 농업에 미치는 영향은 매우 크다고 할 수 있다[2].

대표적인 PGPR로는 Azotobacter spp., Pseudomonas spp. 그리고 Bacillus spp.가 있다. Azotobacter속은 indole acetic acid, 사이토카인(cytokine)과 같은 식물호르몬을 생산하여 식물 생장에 직접적으로 영향을 준다고 잘 알려져 있으며[3], Azospirillum속 또한 다양한 식물호르몬을 생산하여 뿌리세포의 분화와 수분 흡수를 촉진시킨다고 알려져 있다[4]. 식물병 방제에도 역할을 하는데, 항생물질을 분비하여 직접적으로 작용하거나 siderophore를 생산하여 병원균의 생장을 저해한다. Rhizobium japonicum는 rhizobitoxine이라는 항생물질을 생산하여 콩의 뿌리나 줄기에 균핵마름병(charcoal rot disease)을 유발하는 식물병원성 곰팡이인 Macrophomina phaseolina의 생장을 억제한다[5]. Novozyme에서 판매하는 Actinovate는 Streptomyces lydicus WYEC 108균주 자체를 상업화한 제품으로 조경 및 농업 분야에서항진균제로서 사용되고 있다[6].

Bacillus속은 PGPR 중에서도 식물뿌리 주변에 많이 분포하고 있는 대표적인 세균으로, 포자를 생산하는 그람양성균이며, 식물 생장을 촉진하거나 수확량을 증가시킨다고 알려져 있을 뿐만 아니라 다양한 항생물질을 생산하는 강력한 생물방제제이다[7, 8]. 특히 Bacillus subtilis는 유전체의 4−5%가 항생 물질 생산에 관여하며[9], 그 작용 범위는 그람양성균 뿐만 아니라 그람음성균과 곰팡이까지 넓기 때문에 산업적으로 응용 가치가 높다.

Bacillus속은 200개 이상의 종으로 분류되는데, B. amyloliquefaciens, B. methylotrophicus, B. subtilis로 분류되었던 일부 종이 최근 B. velezensis로 재분류 되었다[10]. B. velezensis는 토양에 흔히 존재하며 다양한 항생물질들을 생산해 PGPR의 역할도 수행한다고 알려져 있다. B. velezensis가 생산할 수 있는 항생물질들은 크게 폴리케타이드(polyketide), 리보솜 펩타이드(ribosomal peptide), 비리보솜 펩타이드(non-ribosomal peptide, NRP), 휘발성 화합물이 있으며 이들은 각 물질의 특성에 따라 항균, 항진균, 항바이러스 등의 효과를 보인다[11]. 박테리오신은 리보솜 펩타이드의 대표적인 물질로, 5 kDa에서 30 kDa 정도 크기를가지는 1차 대사산물이다[12]. 열에 대해 매우 안정하며 생물학적 식품보존제로서 각광받고 있다[13]. 폴리케타이드는acyl CoA 전구체로부터 합성되는 물질로 tetracycline이 여기에 속하며 구조적으로 매우 다양하다[14]. 리포펩타이드(lipopeptide)는 NRP에 속하는 화합물로 아미노산 고리 구조와 선형으로 이루어진 지방산 사슬의 구조를 동시에 갖기 때문에 양극성을 나타낸다. 구조적 특징 때문에 생물학적 계면활성제로도 불리며 Brevibacterium aureum과 같은 다른 미생물에서도 생성되지만 주로 Bacillus 속에서 많이 생산된다[15]. 대표적인 리포펩타이드로는 surfactin, iturin과fengycin이 있으며 새로운 리포펩타이드에 대한 탐색이 꾸준히 진행되고 있다[16].

작물의 수확량은 식물병원성 미생물과 같은 외부 요인에 쉽게 영향을 받기 때문에 식물병 방제에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있다. 안전한 먹거리에 대한 수요의 증가와 내성 균주 출현에 대한 경각심으로 인해 유용미생물을 이용한 생물학적 방제제에 대한 관심이 높아지는 추세이다[17, 18]. 본 연구에서는 흔히 식용되는 식물인 아욱(Malva verticillata)에서 분리된 B. velezensis MV2의 항균 및 항진균 활성을 검사하고, 전장 유전체 분석을 통해 항생물질을 암호화하는 유전자들을 탐색하여 생물학적 방제제로서의 가능성을 확인하고자 하였다.

균주 분리 및 동정

부산광역시 지역 마켓에서 구매한 아욱(Malva verticillata)을 세척하여 오염물질을 제거한 뒤 60℃에서 12시간 동안 건조하였다. 건조 후 파쇄된 아욱 분말을 121℃에서 15분간 고압 멸균한 뒤 Yeast extract Peptone Dextrose (YPD, BD Difco, USA) 한천 배지에 도말하여 30℃에서 배양하였다. 순수 분리된 균주의 동정을 위하여 16S rRNA유전자 염기서열 분석을 수행하였다. 범용 프라이머인785F (5'-GGATTAGATACCCTGGTA-3')와 907R (5'-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3')을 이용하여 염기서열 정보를 확인하였고(Macrogen, Korea), NCBI (https://www.ncbi. nlm.nih.gov/)의 BLAST에서 기존에 등록된 균주들과의 상동성을 비교하여 동정하였다. 이후 아욱에서 분리된 균주는Tryptic Soy Broth (TSB, BD Difco) 배지에 37℃에서 배양되었다.

유전체 염기서열 결정 및 계통학적 분석

B. velezensis MV2 균을 TSB에 접종하고 30℃에서 18시간 이상 배양한 뒤, QIAamp DNA mini kit (Qiagen, USA)를 사용하여 제조사가 제공한 방법에 따라 유전체 DNA를추출하였다. 추출된 DNA의 유전정보 서열은 PacBio Sequel system (Pacific Biosciences, USA)을 이용해 시퀀싱되었고, SMRTlink HGAP 4.0 pipeline을 이용해 assembly되었다. NCBI의 Prokaryotic Genome Annotation Pipeline을 이용해annotation을 진행하였으며, 유전체 서열을 시각화하기 위해 CGView Server (http://cgview.ca/)로 해독된 서열들과GC 함량 정보들을 함께 나타내었다. 전체 염기서열 중 16S rRNA 서열을 기반으로 BLAST를 이용해 상동성을 확인했다. NCBI에서 13개의 Bacillus속 균주의 유전자 염기서열을 얻었고 계통도 작성를 위해 MEGA X 프로그램의 Clustal W를 이용하여 염기서열을 정렬하였으며, neighbor-joining알고리즘을 사용하여 1,000회 반복 bootstraping을 통해 계통도의 신뢰성을 확인하였다. 다른 균주와 유전체 정보상의 유사도를 확인하기 위해 B. velezensis FZB42, B. amyloliquefaciens DSM7와 비교하였다.

해당 서열은 NCBI Sequin 프로그램을 이용해 GenBank에 제출되었고, 등록된 accession number는 CP059405이다.

분리된 균주로부터 항생물질 조추출

B. velezensis MV2 전배양액을 1%로 접종한 TSB 100 ml를 37℃에서 정지기(Stationary phase)에 도달하는 48시간 동안 교반 배양하였다. 본배양액을 22,000 ×g로 15분 동안 원심분리하여 상등액을 얻고, 0.45 µm pore size의 membrane filter (SciLab, Korea)로 여과하였다. 상등액은 C18 syringe cartridge 컬럼(Phenomenex, USA)을 통과시킨 뒤 94% 메탄올로 용출하였다. 메탄올을 제거하기 위해 회전진공농축기(Eyela, Singapore)를 이용해 60℃에서 분획을 농축하였다. 건조된 시료의 무게를 측정한 뒤 20 mM Tris-HCl (pH 8.0) 완충액 1 ml에 현탁하였고, 이렇게 얻어진 항균물질 조추출물을 항균 활성 및 항진균 활성 측정 실험에 사용하였다.

항균 활성 측정

분리 균주로부터 얻은 조추출물의 병원성 세균에 대한 항균 활성을 조사하기 위해 부산대학교 미생물학과에 보관중인 B. cereus, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Streptococcus iniae, S. parauberis, Burkholderia glumae, Escherichia coli, Edwardciella tarda, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio furnissii, V. alginolyticus, V. mimicus, V. campbellii, V. vulnificus, V. harveyi, V. parahaemolyticus, V. ordalii, V. fluvialis 총 19종을 대상으로 검정하였다. Vibrio 속은 TSB에 NaCl을1%로 첨가한 배지를 사용하였고 Streptococcus 속은 Brain Heart Infusion (BHI, BD Difco, USA) 배지를, B. cereus, E. coliB. glumae는 Luria-bertani (LB) 배지를 사용하였다. 그 외의 균주에 대해서는 TSB 배지를 사용하였다. 직경8 mm의 멸균된 디스크 여과지(Advantec, Japan)를 사용하여 디스크 확산법으로 실행하였다. 각 병원성 세균 전배양액을 분광광도계를 이용하여 600 nm에서 측정된 흡광도가 1.0이 될 때까지 키운 뒤, 10배 희석액 200 µl를 top agar (0.5%agar, 0.6% NaCl) 5 ml과 혼합하여 각각의 고체배지에 부었다. 30분 동안 굳힌 뒤 디스크 여과지를 올려 균주의 상등액으로부터 얻어진 조추출액 10 mg을 처리하였다. 37℃에서 10시간 배양한 뒤 관찰되는 생육억제환의 직경을 측정하였다.

항진균 활성 측정

항생물질 조추출물의 항진균 활성을 조사하기 위해 부산대학교 미생물학과에 보관중인 Aspergillus oryzae, A. niger, Rhizopus oryzae, Fusarium graminearum, F. fujikuroi, Trichoderma longibrachiatum을 대상으로 실험하였다. 조추출물의 농도가 1 mg/ml이 되도록 첨가한 Potato Dextrose Agar (PDA, BD Difco, USA) 배지에 대상 진균이 자란 배지를 cork borer (3.5 mm; Daihan Scientific Co. Ltd., Korea)로뚫어서 접종하였다. 이를 28℃에서 40시간 동안 배양하며 진균의 생장을 관찰하였다.

Time kill assay

B. velezensis MV2가 생산하는 항미생물질이 갖는 작용 기작에 대해 조사하기 위해 B. cereus를 indicator로 채택하여 실험을 진행하였다. LB 배지 30 ml에 600 nm에서의 흡광도가 0.1이 되도록 B. cereus 전배양액을 접종하였다. 37℃에서 교반 배양하면서 흡광도를 측정하였고, 그 값이 0.5−0.6 범위에 도달하였을 때 항생물질 조추출물을 처리하였다.각 처리 농도는 0, 12.5, 25, 50, 100과 200 µg/ml이 되도록 하였다. 이 후 항생물질 조추출물을 처리하지 않은 B. cereus의 생장이 정지기에 들어갈 때까지 흡광도를 측정하여 생장곡선의 변화를 관찰하였다.

이차 대사산물의 생합성 관련 유전자군 비교

NCBI에 등록된 Genbank 파일을 이용해 anti SMASH 5.0 (https://antismash. secondarymetabolites.org/#!/start)에서B. velezensis MV2 유전체에 존재하는 이차 대사산물의 생성과 관련된 유전자들을 예측하였다[19].

미생물의 분리 및 동정

건조 멸균한 아욱에 A. oryzae를 첨가하였을 때 A. oryzae의 생장이 억제되는 현상을 확인하였고, 아욱에 존재하는 자생균의 항진균 활성으로 예측되어 이를 고체 배지에 배양한후 집락을 얻었다. 해당 미생물을 16S rRNA 유전자 기반으로 BLAST search한 결과, B. velezensis CR-502가 99.71%, B. subtilis 168이 99.72%, B. amyloliquefaciens DSM7이99.72%의 identity를 갖는 것으로 나타났다. 계통수를 작성하여 분석한 결과, 기존에 밝혀져 있던 B. velezensis들과 구분되었고 9개의 B. velezensis 균주를 포함한 총 13개의Bacillus속 중에서 B. velezensis CR-502 균주와 통계학적으로 가장 근접하였다(Fig. 1). 따라서 아욱에서 분리된 균주는 Bacillus velezensis MV2라고 명명하였다.

Figure 1.Phylogenetic tree based on 16S rRNA sequences using the Neighbor-Joining method in MEGA X. Bootstrap values (1,000 replicates) were shown at the branch points. B. velezensis CR-502 (MG846018.1), B. velezensis FZB42 (NC009725.2), B. velezensis M75 (NZ CP016395.1), B. velezensis BCRC 17467 (EF433407.1), B. velezensis NRRL B-41580 (KY694464.1), B. subtilis 168 (NR102783.1), B. subtilis IAM 12118 (NR112116.2), B. amyloliquefaciens DSM7 (FN597644.1), B. amyloliquefaciens NBRC 15535 (MK182997.1), B. velezensis CAU B946 (NC016784.1), B. velezensis GH1-13 (CP019040.1), B. velezensis QST713 (NZ CP025079.1), and B. atrophaeus JCM 9070 (NR024689.1) are compared with B. velezensis MV2.

전장 유전체 염기서열 분석

유전체 염기서열 분석 결과, B. velezensis MV2는 GC 함량이 45.57%인 4,191,702 bp 크기의 1개 컨티그(contig)를 가지는 것으로 확인되었다(Fig. 2). 전체 유전자의 개수는4,253개로 나타났으며, 이중 암호화 유전자(coding sequence)와 RNA 유전자의 개수는 각각 4,135개와 118개로 나타났다. RNA는 tRNA가 86개, rRNA의 경우 총 27개(5S 9개, 16S 9개, 23S 9개), 비암호화 RNA (non-coding RNA)가 5개존재하는 것으로 분석되었다. 이는 유사 균주인 B. velezensisB. amyloliquefaciens와 비교하였을 때, 매우 유사하게 나타난 것을 알 수 있었다(Table 1).

Table 1 . Genome characteristics of B. velezensis MV2 compared with other Bacillus sp.

FeaturesB. velezensis MV2B. velezensis FZB42B. amyloliquefaciens DSM7
Size (bp)4,191,7023,918,5963,980,199
G+C content (%)45.5746.4846.08
RepliconsOne chromosomeOne chromosome
Total genes4,2533,9214,102
Predicted No. of CDS4,1353,7993,974
Ribosomal RNA272930
Transfer RNA868993
other RNA545
Pseudogene10489123
GenBank IDCP059405NC009725NC014551


Figure 2.Complete genome map of B. velezensis MV2. The image shows (from outside to center): genes on the forward strand, genes on the reverse strand (coding sequences in blue, tRNAs in orange, rRNAs in red). The GC content is in black with peaks indicating higher or lower values than the average GC content (peaks out/inside, respectively). The inner circle shows the GC skew. Positive values correspond to green peaks, indicating that the amounts of guanines are enriched in the top strand versus the amount of cytosines in the bottom strand. Purple peaks represent the opposite.

항미생물 활성 검정

B. velezensis MV2 배양액으로부터 상등액을 얻어 소수성물질과 친수성 물질로 분리한 결과, 소수성 물질에서 높은 항균활성을 관찰할 수 있었다. 확인된 소수성 조추출물을 이용하여 이후 항미생물 활성을 확인하였다. 다양한 병원성 세균을 대상으로 디스크 확산법 실험을 수행한 결과, 그람양성균에서는 S. aureus를 제외한 모든 균에서 활성이 관찰되었으며 특히 B. cereus에서 가장 높은 항균 활성이 나타났다. 그람음성균에서는 V. furnissiiV. alginolyticus에서 활성이 관찰되었다. 전반적인 세균에 대한 항균활성 검사는 그람음성균보다 그람양성균에서 더 높은 활성을 보였다(Table 2).

Table 2 . Antibacterial activity of antimicrobial substance produced from B. velezensis MV2.

Indicator strainDiameter of inhibition zone (mm)
Gram positive bacteria
Bacillus cereus14.2 ± 0.7a
Listeria monocytogenes10.7 ± 1.1
Staphylococcus aureusNDb
Streptococcus iniae11.6 ± 0.4
Streptococcus parauberis12.0 ± 0.4
Gram negative bacteria
Vibrio furnissii14.0 ± 3.3
Vibrio alginolyticus13.7 ± 2.5
Vibrio mimicusND
Vibrio campbelliiND
Vibrio vulnificusND
Vibrio harveyiND
Vibrio parahaemolyticusND
Vibrio ordaliiND
Vibrio fluvialisND
Burkholderia glumaeND
Escherichia coli DH5αND
Edwardsiella tardaND
Klebsiella pneumoniaeND
Pseudomonas aeruginosaND

aData are mean ± standard deviation of at least three replicates.

bND: not detected.



특히 6개의 진균을 대상으로 실험한 결과 모든 진균에 대해 강한 저해 활성을 보였다(Fig. 3). 특히 벼의 주요 곰팡이 병원균인 F. fujikuroi (키다리병균)와 밀과 보리의 주 병원균인 F. graminearum (푸사리움머리병해균)에 대한 항진균활성이 매우 강하였다. L. lactis가 생산하는 nisin과 같은 박테리오신의 경우 대체로 그람양성균에만 효과가 있는 것으로 알려져 있다[20, 21]. 한편 폴리케타이드 생합성 효소에 의해 생산되는 bacillaene의 경우 그람음성균과 그람양성균 모두에 효과를 나타내며 Fusarium sp.와 Trichoderma sp.에도 저해활성을 갖는다고 알려져 있다[22, 23]. Bacillus 속이 생산하는 리포펩타이드인 iturin과 fengycin은 Xanthomonas campestris Cucurbitae (갈색무늬세균병), Rhizoctonia solani (잎집무늬마름병균)과 F. graminearum 등의 주요 곰팡이 병원균에 대해 생육 억제 활성을 갖는 것으로 알려져 있다[24, 25]. 소수성 물질에서 항균활성이 나타났다는 것과 확인된 항미생물 활성의 스펙트럼을 통해 B. velezensis MV2에서 분리된 항생물질은 박테리오신으로 추측하기는 어려우며, 폴리케타이드나 비리보솜 계열의 리포펩타이드로 예상되었다.

Figure 3.Antifungal activity of antimicrobial substance produced from B. velezensis MV2. (A) A. oryzae, (B) R. oryzae, (C) A. niger, (D) F. fujikuroi, (E) F. graminearum, (F) T. longibrachiatum. I, Untreated; II, Treated with crude extract (1 mg/ml).

항미생물질의 작용기작 분석

항생물질의 작용기작을 확인하기 위해 Time kill assay 실험을 진행하였다. Indicator 균주인 B. cereus에 조추출물을 농도별로 처리한 결과, 모든 농도에 대해 B. cereus의 생장이 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 이를 바탕으로 해당 항균물질의 작용기작은 균을 용해시키는 살균작용(bactericidal effect) 특성임을 알 수 있었다(Fig. 4). 조추출물의 여러 농도 조건 중에서도 100 µg/ml과 200 µg/ml의 농도로 처리했을 때 흡광도가 급격히 감소하여 그 특성을 뚜렷이 관찰할 수 있었다. 특히 200 µg/ml의 농도에서는 다른 농도 조건과 달리 물질을 처리하지 않은 B. cereusr가 정지기에 도달한 이후 시간 까지도 저해된 생장이 유지되었다. 200 µg/ml의 농도 처리시를 제외하고는 감소했던 생장이 시간이 지남에 따라 생장이 복구되는 양상이 관찰되었는데, 이는 처리한 조추출물의 농도가 낮아질수록 빠르게 복구되었다. 이러한 현상은 항생제 내성을 갖는 돌연변이 균주의 출현으로 추측되며[26], 조추출물은 여러 물질이 혼합되었을 가능성이 있기 때문에 추가적인 정제 과정을 통한 후속 연구가 필요할 것으로 생각된다.

Figure 4.Mode of action of antimicrobial substance produced from B. velezensis MV2 strain against B. cereus. The arrow indicates the point at which crude extract was added to the culture. Error bar indicates standard deviations from three independent experiments. Untreated control (○); 12.5 μg/ml treatment (●); 25 μg/ml treatment (□); 50 μg/ml treatment (■); 100 μg/ml treatment (△); 200 μg/ml treatment (▲).

이차 대사산물 생합성 유전자 기반 생성 물질 탐색

항균활성을 보이는 조추출물은 B. velezensis MV2의 생장기 중 정지기에 생산되었으며 앞선 실험의 항균활성 스펙트럼을 통해 해당 물질은 일차대사산물 계통보다는 이차대사산물 형태의 항균물질로 생각되었다. 따라서 전장 유전체 염기서열 분석을 통해 얻은 B. velezensis MV2의 유전체를 활용하여 항미생물활성과 관련된 이차대사산물 생합성 유전자의 예측을 위해 antiSMASH 5.0 알고리즘을 이용하였다. antiSMASH는 원핵생물의 유전정보를 바탕으로 항생물질 혹은 이차대사산물의 생합성 유전자군(biosynthetic gene clusters, BGCs)을 탐색하여 예측되는 생합성 물질의 정보를 제공한다. 전체 서열로부터 총 14개의 영역 중 8개 영역에서 47종류의 이차대사산물의 생합성이 예측되었으며, 그 중에서 기존에 밝혀져 있는 물질들과 유사도가 80% 이상으로 나타나는 물질은 14개로 확인되었다(Table 3).

Table 3 . Gene clusters involved in the synthesis of secondary metabolites in B. velezensis MV2 using antiSMASH.

RegionFromToMost similar known clusterSubstanceSimilarity
Region 1160978242046Polyketide + NRPdifficidin86%
Region 2907772957290NRPbacillibactin100%
NRPpaenibactin100%
NRP:NRP siderophorebacillibactin100%
RiPP:Head-to-tail cyclized peptideamylocyclicin100%
Region 314808311522249Otherbacilysin100%
Otherbacilysin100%
Region 621947652259809NRP:Lipopeptidesurfactin82%
Region 1133349113421250Polyketidemacrolactin100%
Polyketidemacrolactin100%
Region 1236902863779337Polyketide + NRPbacillaene100%
Region 1339646424099723NRPfengycin93%
NRPplipastatin92%
Polyketide + NRP Lipopeptidebacillomycin D90%
NRP + Polyketidemycosubtilin100%
NRP + Polyketideiturin88%
NRPpaenilarvins100%

NRP, Non-ribosomal peptide; RiPP, Ribosomally synthesized and post-translationally modified peptides.



B. velezensis MV2 유전체 내에 이차대사산물 생성 유전자 cluster는 non-ribosomal peptide (NRP), polyketide, NRP siderophore, ribosomally synthesized and post-translationally modified peptide (RiPP), lipopeptide gene cluster가 존재하는 것으로 예상되었으며, 이 유전자 cluster는 이차대사산물로 difficidin, bacillibactin, paenibactin, amylocyclicin, bacilysin, surfactin, macrolactin, bacillaene, fengycin, plipastatin, bacillomycin D, mycosubtilin, iturin 및paenilarvins 생합성에 관여하는 것으로 확인되었다.

기존의 연구에서 antiSMASH를 이용한 이차대사산물 생합성 유전자 cluster를 예측한 후 실제 항미생물 활성물질을 확인해 보고한 바 있다. Stincone 연구팀에 따르면, B. velezensis P34 유전체에서 예측된 유사도가 75% 이상인7가지 물질(macrolactin, surfactin, fengycin, bacillaene, bacilysin, difficidin, bacillibactin) 중 iturin, bacillomycin과 fengycin의 실제 항미생물적 활성이 확인되었다[27]. 유전체에 존재하는 생합성 유전자와 분리된 항균물질의 특성을 고려하였을 때, B. velezensis MV2에서 예측된 14개 항미생물 활성물질들 중 실제 활성을 나타내는 물질은 비리보솜펩타이드 계열의 리포펩타이드 물질일 것으로 예상할 수 있다. 이 결과를 통해 B. velezensis MV2 균주가 벼를 포함한다양한 작물의 병해 방제를 위한 미생물제로서의 잠재적 가치가 큰 것으로 평가된다. 향후 해당 연구를 바탕으로 항균물질의 동정과 본 균주의 현장 적용성 평가가 수행되어야 할 것으로 판단되며, 이를 바탕으로 토착 세균을 이용한 우수한미생물제로서의 활용 가능성 및 다양한 병원균에 대한 생육억제 활성 기작에 대한 추가적인 연구가 진행되어야 할 것으로 여겨진다.

본 연구에서는 국내 자생 식물인 아욱으로부터 새로운 균주를 분리 및 동정하였고 해당 미생물이 생산하는 항미생물질의 활성과 관련 생합성 유전자들을 확인하고자 하였다. 16S rRNA 유전자 서열 정보를 토대로 비교한 결과, 아욱에서 분리된 균주는 Bacillus velezensis이었으며 strain은MV2라고 명명되었다. 유전체 염기서열 분석을 통해 전체 유전정보를 확인할 수 있었으며, 45.57% GC 함량을 가지는4,191,702 bp 크기의 1개 컨티그(contig)가 존재하는 것으로 확인되었다. B. velezensis MV2가 정지기에 생산하는 물질중 항균 활성이 확인된 소수성 물질 분획을 이용하여 항균활성 스펙트럼 테스트를 진행한 결과, 그람음성균보다 그람양성균에서 더 높은 억제능이 확인되었다. 6종의 곰팡이를 이용한 항진균 활성 테스트에서는 모든 진균에 대해 강한 저해 활성을 보였으며, 특히 F. fujikuroiF. graminearum에 대한 항진균 활성이 매우 강하게 나타났다. 세균에 대한 항균물질의 작용 기작 분석을 통해 해당 항균물질은 균을 용해시키는 살균(bactericidal) 특성을 가진 것으로 추측할 수 있었다. B. velezensis MV2의 유전체 염기서열 정보를 통해 이차대사산물 생합성 유전자 cluster를 탐색한 결과 총 47가지 이차대사산물 생산이 예측되었으며, 기존에 밝혀져 있는 물질들과 유사도 80% 이상인 물질은 14개로 확인되었다. 앞서 확인된 내용들을 바탕으로 B. velezensis MV2에서 생성되는 항균물질은 비리보솜 펩타이드성 물질로 예상되며, 향후 항균물질의 동정과 활용 가능성에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각되었다. 기존에 상업적으로 이용되었던 곰팡이에 대한 활성이 낮은 항균물질 생물제제들과 함께 복합기능성 미생물제로 활용하여 식품산업 및 농업에서의 이용 가능성이 있음을 보여주었다.

This research was supported by PNU-RENovation (2019-2020).

The authors have no financial conflicts of interest to declare.

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