미생물의 분리 및 동정
건조 멸균한 아욱에 A. oryzae를 첨가하였을 때 A. oryzae의 생장이 억제되는 현상을 확인하였고, 아욱에 존재하는 자생균의 항진균 활성으로 예측되어 이를 고체 배지에 배양한후 집락을 얻었다. 해당 미생물을 16S rRNA 유전자 기반으로 BLAST search한 결과, B. velezensis CR-502가 99.71%, B. subtilis 168이 99.72%, B. amyloliquefaciens DSM7이99.72%의 identity를 갖는 것으로 나타났다. 계통수를 작성하여 분석한 결과, 기존에 밝혀져 있던 B. velezensis들과 구분되었고 9개의 B. velezensis 균주를 포함한 총 13개의Bacillus속 중에서 B. velezensis CR-502 균주와 통계학적으로 가장 근접하였다(Fig. 1). 따라서 아욱에서 분리된 균주는 Bacillus velezensis MV2라고 명명하였다.
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Figure 1.Phylogenetic tree based on 16S rRNA sequences using the Neighbor-Joining method in MEGA X. Bootstrap values (1,000 replicates) were shown at the branch points. B. velezensis CR-502 (MG846018.1), B. velezensis FZB42 (NC009725.2), B. velezensis M75 (NZ CP016395.1), B. velezensis BCRC 17467 (EF433407.1), B. velezensis NRRL B-41580 (KY694464.1), B. subtilis 168 (NR102783.1), B. subtilis IAM 12118 (NR112116.2), B. amyloliquefaciens DSM7 (FN597644.1), B. amyloliquefaciens NBRC 15535 (MK182997.1), B. velezensis CAU B946 (NC016784.1), B. velezensis GH1-13 (CP019040.1), B. velezensis QST713 (NZ CP025079.1), and B. atrophaeus JCM 9070 (NR024689.1) are compared with B. velezensis MV2.
전장 유전체 염기서열 분석
유전체 염기서열 분석 결과, B. velezensis MV2는 GC 함량이 45.57%인 4,191,702 bp 크기의 1개 컨티그(contig)를 가지는 것으로 확인되었다(Fig. 2). 전체 유전자의 개수는4,253개로 나타났으며, 이중 암호화 유전자(coding sequence)와 RNA 유전자의 개수는 각각 4,135개와 118개로 나타났다. RNA는 tRNA가 86개, rRNA의 경우 총 27개(5S 9개, 16S 9개, 23S 9개), 비암호화 RNA (non-coding RNA)가 5개존재하는 것으로 분석되었다. 이는 유사 균주인 B. velezensis및 B. amyloliquefaciens와 비교하였을 때, 매우 유사하게 나타난 것을 알 수 있었다(Table 1).
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Table 1 . Genome characteristics of B. velezensis MV2 compared with other Bacillus sp.
Features | B. velezensis MV2 | B. velezensis FZB42 | B. amyloliquefaciens DSM7 |
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Size (bp) | 4,191,702 | 3,918,596 | 3,980,199 |
G+C content (%) | 45.57 | 46.48 | 46.08 |
Replicons | One chromosome | One chromosome | |
Total genes | 4,253 | 3,921 | 4,102 |
Predicted No. of CDS | 4,135 | 3,799 | 3,974 |
Ribosomal RNA | 27 | 29 | 30 |
Transfer RNA | 86 | 89 | 93 |
other RNA | 5 | 4 | 5 |
Pseudogene | 104 | 89 | 123 |
GenBank ID | CP059405 | NC009725 | NC014551 |
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Figure 2.Complete genome map of B. velezensis MV2. The image shows (from outside to center): genes on the forward strand, genes on the reverse strand (coding sequences in blue, tRNAs in orange, rRNAs in red). The GC content is in black with peaks indicating higher or lower values than the average GC content (peaks out/inside, respectively). The inner circle shows the GC skew. Positive values correspond to green peaks, indicating that the amounts of guanines are enriched in the top strand versus the amount of cytosines in the bottom strand. Purple peaks represent the opposite.
항미생물 활성 검정
B. velezensis MV2 배양액으로부터 상등액을 얻어 소수성물질과 친수성 물질로 분리한 결과, 소수성 물질에서 높은 항균활성을 관찰할 수 있었다. 확인된 소수성 조추출물을 이용하여 이후 항미생물 활성을 확인하였다. 다양한 병원성 세균을 대상으로 디스크 확산법 실험을 수행한 결과, 그람양성균에서는 S. aureus를 제외한 모든 균에서 활성이 관찰되었으며 특히 B. cereus에서 가장 높은 항균 활성이 나타났다. 그람음성균에서는 V. furnissii와 V. alginolyticus에서 활성이 관찰되었다. 전반적인 세균에 대한 항균활성 검사는 그람음성균보다 그람양성균에서 더 높은 활성을 보였다(Table 2).
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Table 2 . Antibacterial activity of antimicrobial substance produced from B. velezensis MV2.
Indicator strain | Diameter of inhibition zone (mm) |
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Gram positive bacteria |
Bacillus cereus | 14.2 ± 0.7a |
Listeria monocytogenes | 10.7 ± 1.1 |
Staphylococcus aureus | NDb |
Streptococcus iniae | 11.6 ± 0.4 |
Streptococcus parauberis | 12.0 ± 0.4 |
Gram negative bacteria |
Vibrio furnissii | 14.0 ± 3.3 |
Vibrio alginolyticus | 13.7 ± 2.5 |
Vibrio mimicus | ND |
Vibrio campbellii | ND |
Vibrio vulnificus | ND |
Vibrio harveyi | ND |
Vibrio parahaemolyticus | ND |
Vibrio ordalii | ND |
Vibrio fluvialis | ND |
Burkholderia glumae | ND |
Escherichia coli DH5α | ND |
Edwardsiella tarda | ND |
Klebsiella pneumoniae | ND |
Pseudomonas aeruginosa | ND |
aData are mean ± standard deviation of at least three replicates.
bND: not detected.
특히 6개의 진균을 대상으로 실험한 결과 모든 진균에 대해 강한 저해 활성을 보였다(Fig. 3). 특히 벼의 주요 곰팡이 병원균인 F. fujikuroi (키다리병균)와 밀과 보리의 주 병원균인 F. graminearum (푸사리움머리병해균)에 대한 항진균활성이 매우 강하였다. L. lactis가 생산하는 nisin과 같은 박테리오신의 경우 대체로 그람양성균에만 효과가 있는 것으로 알려져 있다[20, 21]. 한편 폴리케타이드 생합성 효소에 의해 생산되는 bacillaene의 경우 그람음성균과 그람양성균 모두에 효과를 나타내며 Fusarium sp.와 Trichoderma sp.에도 저해활성을 갖는다고 알려져 있다[22, 23]. Bacillus 속이 생산하는 리포펩타이드인 iturin과 fengycin은 Xanthomonas campestris Cucurbitae (갈색무늬세균병), Rhizoctonia solani (잎집무늬마름병균)과 F. graminearum 등의 주요 곰팡이 병원균에 대해 생육 억제 활성을 갖는 것으로 알려져 있다[24, 25]. 소수성 물질에서 항균활성이 나타났다는 것과 확인된 항미생물 활성의 스펙트럼을 통해 B. velezensis MV2에서 분리된 항생물질은 박테리오신으로 추측하기는 어려우며, 폴리케타이드나 비리보솜 계열의 리포펩타이드로 예상되었다.
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Figure 3.Antifungal activity of antimicrobial substance produced from B. velezensis MV2. (A) A. oryzae, (B) R. oryzae, (C) A. niger, (D) F. fujikuroi, (E) F. graminearum, (F) T. longibrachiatum. I, Untreated; II, Treated with crude extract (1 mg/ml).
항미생물질의 작용기작 분석
항생물질의 작용기작을 확인하기 위해 Time kill assay 실험을 진행하였다. Indicator 균주인 B. cereus에 조추출물을 농도별로 처리한 결과, 모든 농도에 대해 B. cereus의 생장이 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 이를 바탕으로 해당 항균물질의 작용기작은 균을 용해시키는 살균작용(bactericidal effect) 특성임을 알 수 있었다(Fig. 4). 조추출물의 여러 농도 조건 중에서도 100 µg/ml과 200 µg/ml의 농도로 처리했을 때 흡광도가 급격히 감소하여 그 특성을 뚜렷이 관찰할 수 있었다. 특히 200 µg/ml의 농도에서는 다른 농도 조건과 달리 물질을 처리하지 않은 B. cereusr가 정지기에 도달한 이후 시간 까지도 저해된 생장이 유지되었다. 200 µg/ml의 농도 처리시를 제외하고는 감소했던 생장이 시간이 지남에 따라 생장이 복구되는 양상이 관찰되었는데, 이는 처리한 조추출물의 농도가 낮아질수록 빠르게 복구되었다. 이러한 현상은 항생제 내성을 갖는 돌연변이 균주의 출현으로 추측되며[26], 조추출물은 여러 물질이 혼합되었을 가능성이 있기 때문에 추가적인 정제 과정을 통한 후속 연구가 필요할 것으로 생각된다.
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Figure 4.Mode of action of antimicrobial substance produced from B. velezensis MV2 strain against B. cereus. The arrow indicates the point at which crude extract was added to the culture. Error bar indicates standard deviations from three independent experiments. Untreated control (○); 12.5 μg/ml treatment (●); 25 μg/ml treatment (□); 50 μg/ml treatment (■); 100 μg/ml treatment (△); 200 μg/ml treatment (▲).
이차 대사산물 생합성 유전자 기반 생성 물질 탐색
항균활성을 보이는 조추출물은 B. velezensis MV2의 생장기 중 정지기에 생산되었으며 앞선 실험의 항균활성 스펙트럼을 통해 해당 물질은 일차대사산물 계통보다는 이차대사산물 형태의 항균물질로 생각되었다. 따라서 전장 유전체 염기서열 분석을 통해 얻은 B. velezensis MV2의 유전체를 활용하여 항미생물활성과 관련된 이차대사산물 생합성 유전자의 예측을 위해 antiSMASH 5.0 알고리즘을 이용하였다. antiSMASH는 원핵생물의 유전정보를 바탕으로 항생물질 혹은 이차대사산물의 생합성 유전자군(biosynthetic gene clusters, BGCs)을 탐색하여 예측되는 생합성 물질의 정보를 제공한다. 전체 서열로부터 총 14개의 영역 중 8개 영역에서 47종류의 이차대사산물의 생합성이 예측되었으며, 그 중에서 기존에 밝혀져 있는 물질들과 유사도가 80% 이상으로 나타나는 물질은 14개로 확인되었다(Table 3).
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Table 3 . Gene clusters involved in the synthesis of secondary metabolites in B. velezensis MV2 using antiSMASH.
Region | From | To | Most similar known cluster | Substance | Similarity |
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Region 1 | 160978 | 242046 | Polyketide + NRP | difficidin | 86% |
Region 2 | 907772 | 957290 | NRP | bacillibactin | 100% |
| | | NRP | paenibactin | 100% |
| | | NRP:NRP siderophore | bacillibactin | 100% |
| | | RiPP:Head-to-tail cyclized peptide | amylocyclicin | 100% |
Region 3 | 1480831 | 1522249 | Other | bacilysin | 100% |
| | | Other | bacilysin | 100% |
Region 6 | 2194765 | 2259809 | NRP:Lipopeptide | surfactin | 82% |
Region 11 | 3334911 | 3421250 | Polyketide | macrolactin | 100% |
| | | Polyketide | macrolactin | 100% |
Region 12 | 3690286 | 3779337 | Polyketide + NRP | bacillaene | 100% |
Region 13 | 3964642 | 4099723 | NRP | fengycin | 93% |
| | | NRP | plipastatin | 92% |
| | | Polyketide + NRP Lipopeptide | bacillomycin D | 90% |
| | | NRP + Polyketide | mycosubtilin | 100% |
| | | NRP + Polyketide | iturin | 88% |
| | | NRP | paenilarvins | 100% |
NRP, Non-ribosomal peptide; RiPP, Ribosomally synthesized and post-translationally modified peptides.
B. velezensis MV2 유전체 내에 이차대사산물 생성 유전자 cluster는 non-ribosomal peptide (NRP), polyketide, NRP siderophore, ribosomally synthesized and post-translationally modified peptide (RiPP), lipopeptide gene cluster가 존재하는 것으로 예상되었으며, 이 유전자 cluster는 이차대사산물로 difficidin, bacillibactin, paenibactin, amylocyclicin, bacilysin, surfactin, macrolactin, bacillaene, fengycin, plipastatin, bacillomycin D, mycosubtilin, iturin 및paenilarvins 생합성에 관여하는 것으로 확인되었다.
기존의 연구에서 antiSMASH를 이용한 이차대사산물 생합성 유전자 cluster를 예측한 후 실제 항미생물 활성물질을 확인해 보고한 바 있다. Stincone 연구팀에 따르면, B. velezensis P34 유전체에서 예측된 유사도가 75% 이상인7가지 물질(macrolactin, surfactin, fengycin, bacillaene, bacilysin, difficidin, bacillibactin) 중 iturin, bacillomycin과 fengycin의 실제 항미생물적 활성이 확인되었다[27]. 유전체에 존재하는 생합성 유전자와 분리된 항균물질의 특성을 고려하였을 때, B. velezensis MV2에서 예측된 14개 항미생물 활성물질들 중 실제 활성을 나타내는 물질은 비리보솜펩타이드 계열의 리포펩타이드 물질일 것으로 예상할 수 있다. 이 결과를 통해 B. velezensis MV2 균주가 벼를 포함한다양한 작물의 병해 방제를 위한 미생물제로서의 잠재적 가치가 큰 것으로 평가된다. 향후 해당 연구를 바탕으로 항균물질의 동정과 본 균주의 현장 적용성 평가가 수행되어야 할 것으로 판단되며, 이를 바탕으로 토착 세균을 이용한 우수한미생물제로서의 활용 가능성 및 다양한 병원균에 대한 생육억제 활성 기작에 대한 추가적인 연구가 진행되어야 할 것으로 여겨진다.