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Microbiology and Biotechnology Letters

단보(Note)

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Biocatalysis and Bioprocess Engineering  |  Bioenergy and Biorefinery

Microbiol. Biotechnol. Lett. 2020; 48(2): 179-184

https://doi.org/10.4014/mbl.2003.03003

Received: March 9, 2020; Accepted: May 25, 2020

시네라리아 꽃으로부터 에탄올 생산성 및 내열성이 우수한 효모 Hanseniaspora opuntiae 균주 분리

Isolation of Ethanol-producing Thermotolerant Yeast Hanseniaspora opuntiae from Senecio cruentus

Jeong-Ah Yoon 1, Young-Eun Do 1, Eun-Hee Park 1, Young-Woo Bae 1 and Myoung-Dong Kim 1, 2*

1Division of Food Biotechnology and Biosystems Engineering, Kangwon National University, Chuncheon 24341, Korea, 2Institute of Fermentation and Brewing, Kangwon National University, Chuncheon 24341, Korea

The MBY/L6793 strain showing the highest ethanol yield of 0.48 ± 0.00 g ethanol/ g glucose was isolated from Senecio cruentus. Its ethanol yield was approximately 1.5 times that of the MBY/L6986 isolated from Callistephus chinensis. The strain was identified as Hanseniaspora opuntiae by sequence analysis of the 18S rRNA gene, and the sequenced gene was registered to the GenBank (MN859968). When grown at 40℃, the strain produced 3.82 ± 0.98 g ethanol from 20 g glucose and 10.05 ± 0.06 g ethanol from 60 g glucose, corresponding to approximately 2.45 and 5.74 times, respectively, compared to the control strain H. opuntiae KCCM50747. The MBY/L6793 strain was deposited to KCTC (Korean Collection for Type Culture) as KCTC37025.

Keywords: Ethanol, yeast, thermotolerance, flower, Hanseniaspora opuntiae

최근 화석연료의 고갈과 원유의 가격상승, 수반되는 환경문제 등으로 인하여 친환경 바이오에너지에 대한 관심이 지속적으로 증가하고 있으며, 전세계적으로 관련 연구가 활발히 진행되고 있다[1, 2].

목질계 바이오매스는 셀룰로스계열의 물질들로 구성되어있어 미생물 발효를 위해서는 전처리공정이 필요하며, 산이나 알칼리를 이용한 화학적 분해방법 또는 cellulase 등의효소를 이용한 가수분해방법이 사용된다[3, 4]. 바이오에탄올을 생산하는 과정에서 동시당화발효(Simultaneous Saccharification and Fermentation)는 분리당화발효(Separate Hydrolysis and Fermentation) 공정보다 상대적으로 시간 및 생산비용 절감 등의 이유로 경제적인 방법으로 평가되지만[5, 6], 당화 온도(45−50℃)와 발효 온도(25− 30℃)의 차이를 극복해야하는 근본적인 문제점이 있다. 따라서, 바이오에탄올을 생산하는데 적합한 균주는 내열성, 내산성, 에탄올 생산성 등의 특성을 갖는 것이 바람직하다[7, 8].

현재까지 토양, 나무 껍질, 썩은 과일, 음식물 쓰레기 등을비롯한 다양한 분리원으로부터 내열성 효모가 분리되었으며[911], 일본의 온천지역의 강으로부터 44℃에서 4.0%의 에탄올을 생산하는 Issatchenkia orientalis [12], 누룩으로부터44℃에서 생육이 가능한 Pichia farinosa [13] 균주 등이 분리된 바 있다. 내열성이 우수한 Kluyveromyces marxianus균주와 에탄올 생산성 및 저해제에 대한 내성이 우수한Saccharomcyces cerevisiae 균주를 융합하는 등 동시당화발효 공정에 적합한 균주를 개발하기 위한 연구가 보고되었다[14].

다양한 분리원으로부터 분리된 내열성 효모는 40℃ 이상의 온도에서 탄소원의 종류 및 농도, 발효저해제 등에 따른에탄올 생산성을 평가한 연구결과들이 보고된 바 있다[911]. Choudhary 등[9]에 따르면 폐수로부터 분리된 Saccharomyces cerevisiae JR6 균주는 cellobiose와 xylose를 대사하지는 못하였으나, furfural과 5-hydroxymethyl furfural과 같은 발효 저해제 내성이 우수하고 전처리한 볏짚에서 40℃으로 배양하였을 때 3.8 g/l의 에탄올을 생산하여 바이오에탄올 생산하기 위한 균주로 선발되었다. Kang등[14]에 따르면 내열성이 우수한 Kluyveromyces marxianus균주와 에탄올 생산성 및 저해제에 대한 내성이 우수한Saccharomcyces cerevisiae 균주를 융합하여 바이오에탄올생산공정에 적합한 내열성이 균주가 개발된 바 있다.

Hanseniaspora opuntiae 균주는 충청남도 금산군 명곡리의 야생화에서 분리 되었으며[15], Vibrio splendidus 감염에 대한 면역성과 내성을 증가시키는 것으로 보고되었다[16]. Baek 등[17]은 발효식품으로부터 고농도의 포도당 및 에탄올이 함유된 배지에서 생육가능한 H. opuntiae 균주를 분리하였다.

본 연구에서는 시네라리아(Senecio cruentus) 꽃으로부터분리한 H. opuntiae 균주의 에탄올 생산특성과 내열성을 평가하였다.

강원도 춘천시에서 수집한 6종의 꽃으로부터 효모를 분리하기 위하여 시료 1 ml을 9 ml의 펩톤수에 현탁하여 적정 농도로 희석한 후, chloramphenicol (100 mg/l, Sigma-Aldrich, USA)이 첨가된 YEPD (yeast extract 10 g/l, peptone 20 g/l, glucose 20 g/l, BD Diagnostic, USA) 평판 배지에 도말하였다. 도말한 평판 배지는 30℃에서 48시간 동안 배양하여 단일집락을 확보하였다.

에탄올 생산성이 우수한 효모를 선발하기 위하여 단일집락을 YEPD 배지에 접종하여 30℃에서 12시간 동안 배양하였다. 배양액을 원심분리(5,000 ×g, 2 min)하여 균체를 회수한 후, 멸균 증류수로 3회 세척하여 10% (w/v) 포도당이 첨가된 100 ml의 YEPD 배지에 세포 흡광도(OD600)가 1.0이되도록 접종하였다. 배양온도 30℃에서 200 rpm의 교반속도로 48시간 동안 배양한 후, 배양액을 회수하여 포도당 및에탄올 농도를 측정하였다.

선발된 균주는 YEPD 배지에 접종하여 30℃에서 200 rpm의 교반속도로 24시간 동안 배양한 후 염색체 유전자를 추출하였다[13]. 프라이머 ITS1 (5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3')과 ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3') [18]를 사용하여 18s rRNA 유전자 단편을 증폭한 후 염기서열을 분석하였다. Blast (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)를사용하여 확보한 염기서열과 문헌에 보고된 균주의 염기서열과의 상동성을 비교하여 균주를 동정하였다. 계통수 분석은 MEGA7 (7.0.26, MEGA software, USA) [19] 프로그램의 이웃연결방법(neighbor-joining method) [20]을 사용하여분석하였다. 탄소원에 대한 균주의 탄소원 대사 특성은 API 20C AUX kit (BioMérieux, France)를 사용하여 조사하였다.

균주의 에탄올 생산과 내열성을 평가하기 위하여 단일집락을 YEPD 배지에 접종하여 30℃에서 배양한 후, 원심분리를 통해 회수된 균체를 멸균 증류수로 3회 세척하여 포도당이 2% 및 6% 농도로 첨가된 YEPD 배지에 세포 흡광도가1.0이 되도록 접종하고 30℃ 및 40℃에서 배양하였다.

포도당 및 에탄올 농도는 Rezex ROA-Organic Acid H+ (Phenomenex, USA) 컬럼과 굴절률 검출기(Shimadzu, Japan)가 장착된 High Performance Liquid Chromatography (Shimadzu)를 이용하여 측정하였다. 이동상으로서 0.005 N의 황산용액(H2SO4)을 0.6 ml/min의 유속으로 흘려주었으며, 컬럼온도는 65℃로 유지하였다. 모든 측정은 3회 이상반복하였으며, SPSS Statistics (v22, IBM, USA)를 이용하여 Duncan의 다중범위 검정법[21]으로 유의성을 검정하였다.

강원도 춘천에서 수집한 꽃으로부터 160점의 효모를 분리하였다. 포도당이 10% 농도로 첨가된 YEPD 배지를 사용하여 30℃에서 48시간 동안 배양하였을 때, 에탄올 생산양과수율이 우수한 7점을 선발하여 에탄올 생산 수율을 조사하였다(Fig. 1). 시네라리아 꽃에서 분리한 MBY/L6793 균주는0.48 ± 0.00 g ethanol/g glucose로 가장 높은 에탄올 생산 수율을 나타냈다. 과꽃(Callistephus chinensis)에서 분리한MBY/L6986 균주는 0.33 ± 0.02 g ethanol/g glucose로 상대적으로 가장 낮은 생산 수율을 나타냈다. MBY/L6793 균주의 에탄올 생산 농도는 47.70 ± 0.22 g/l로 MBY/L6986 균주보다 약 14.79 g/l 높게 나타났다.

Figure 1.Yeast isolates from flowers with high ethanol production yield (□) and production (■). Glucose (100 g/l glucose) was used as a carbon source, and shake flasks cultures (100 ml) were grown at 30℃ for 48 h. Averages and standard errors from three independent cultures are shown. Different letters indicate a significant difference between averages.

Goshima 등[22]의 연구에 따르면 2%의 포도당이 첨가된YEPD배지에서 24시간 동안 배양한 경우 S. cerevisiae BY4743 균주는 0.46 ± 0.00 g ethanol/g glucose [22], K. marxianus NBRC1777 균주는 0.44 ± 0.00 g ethanol/g glucose [22]의 에탄올 생산 수율을 나타내어 시네라리아 꽃에서 분리한 MBY/6793 균주의 에탄올 생산 수율이 상대적으로 우수한 것으로 판단되었다.

MBY/L6793 균주의 18S rRNA 유전자의 염기서열을 분석하여 동정하였다. MBY/L6793 균주는 Hanseniaspora opuntiae (MF940136) 균주와 100%의 상동성을 나타냈으며, 분석된 염기서열은 GenBank에 등록(MN859968)하고Hanseniaspora opuntiae MBY/L6793으로 명명하였다 (Fig. 2).

Figure 2.Phylogenetic tree constructed using the neighbor-joining method [20]. The GenBank accession numbers are shown in parentheses.

H. opuntiae 균주는 충청남도 금산군의 야생화[15]와 예산군 과수원의 과일과 꽃[23]으로부터 분리되어 보고된 바있다. Luan 등[24]의 연구에서 H. opuntiaeS. cerevisiae를 사용하여 와인을 제조하였을 때, S. cerevisiae 단일 균주를 사용한 경우보다 다양한 향기성분을 생성하는 것으로 나타났다.

H. opuntiae MBY/L6793 균주와 대조구로 사용한 H. opuntiae KCCM50747 균주의 탄수화물 대사 특성을 조사한 결과(Table 1), 두 균주 모두 포도당, 2-케토-D-글루콘산,셀로비오즈를 대사하여 H. opuntiae KCCM50747 균주와의유의적인 차이는 나타나지 않았다.

Table 1 . Characteristics of carbohydrate utilization by H. opuntiae KCCM50747 and H. opuntiae MBY/L6793.

CharacteristicsH. opuntiae KCCM50747H. opuntiae MBY/L6793
Control--
Glucose++
Glycerol--
2-Keto-D-Gluconate++
L-Arabitol--
D-Xylose--
Adonitol--
Xylitol--
D-Galactose--
Inositol--
D-Sorbitol--
α-Methyl-D-glucoside--
N-Acetyl-glucosamine--
D Cellobiose++
D-Lactose--
D-Maltose--
D-Saccharose--
D-Trehalose--
D-Melezitose--
D-Raffinose--

+, positive; -, negative.



H. opuntiae MBY/L6793 균주의 에탄올 생산 특성과 내열성을 평가하기 위하여 2%와 6%의 포도당이 첨가된 YEPD배지를 사용하여 30℃ 및 40℃에서 배양하였다(Fig. 3, Table 2). 대조구 균주인 H. opuntiae KCCM50747 와 MBY/L6793 균주는 30℃에서 유사한 수준의 에탄올 생산 농도와수율을 나타냈으나, 40℃에서는 에탄올 생산성의 차이를 타나냈다. H. opuntiae KCCM50747 균주는 20 g의 포도당을첨가한 배지에서 1.56 ± 0.10 g의 에탄올을 생산하였으며, 60 g의 포도당을 첨가한 배지에서는 1.75 ± 0.25 g의 에탄올을 생산하였다. 반면, H. opuntiae MBY/L6793 균주는 각각3.82 ± 0.98 g/l, 10.05 ± 0.06 g/l의 에탄올을 생산하여 대조구인 H. opuntiae KCTC5709 균주보다 약 2.45배 및 5.74배우수한 에탄올 생산 농도를 나타냈다. 포도당을 60 g 첨가한배지에서 H. opuntiae MBY/L6793 균주의 에탄올 생산 속도와 수율은 각각 0.63 ± 0.00 g/l·h, 0.37 ± 0.01 g/g으로 대조구 균주보다 우수한 내열성 및 에탄올 생산성을 나타냈다. H. opuntiae MBY/L6793 균주는 한국생물자원센터에KCTC37025로 기탁하였다.

Table 2 . Effects of temperature on the growth and ethanol production by H. opuntiae KCCM50747 and H. opuntiae MBY/L6793.

Temperature (℃)Glucose (%)H. opuntiae strainCell growth (OD600)Ethanol concentration (g/l)Ethanol production rate (g/l·h)Ethanol yield (g ethanol/g glucose consumed)
302KCCM5074713.60 ± 0.338.91 ± 0.151.11 ± 0.020.46 ± 0.00
MBY/L679316.13 ± 0.748.31 ± 0.310.69 ± 0.010.45 ± 0.00
6KCCM5074718.60 ± 0.4026.69 ± 0.413.34 ± 0.050.43 ± 0.00
MBY/L679322.00 ± 0.7527.93 ± 0.313.49 ± 0.040.46 ± 0.01
402KCCM507472.72 ± 0.101.56 ± 0.100.20 ± 0.010.27 ± 0.00
MBY/L67933.01 ± 0.093.82 ± 0.980.48 ± 0.120.30 ± 0.06
6KCCM507472.60 ± 0.101.75 ± 0.250.11 ± 0.020.22 ± 0.05
MBY/L67934.48 ± 0.1710.05 ± 0.060.63 ± 0.000.37 ± 0.01


Figure 3.Profiles of growth, glucose consumption, and ethanol production by H. opuntiae KCCM50747 (open) and MBY/L6793 (closed) grown in 2% glucose (circle) and 6% glucose (quadrangle). Shake flasks cultures were grown at 30℃ and 40℃. Averages and standard errors from three independent cultures are shown.

본 연구를 통하여 시네라리아 꽃으로부터 분리한 H. opuntiae MBY/L6793 균주의 내열성 및 에탄올 생산성이 대조구 균주인 H. opuntiae KCCM50747 균주와 비교하여 상대적으로 우수한 것을 확인하였으며, 동시당화 발효 등 산업적 활용을 위한 추가연구가 필요할 것으로 판단된다.

다양한 꽃으로부터 분리된 160점의 효모 균주 중 시네라리아 꽃에서 분리된 MBY/L6793은 0.48 ± 0.00 g ethanol/g glucose 으로 분리된 균주 중 가장 우수한 에탄올 생산 수율을 나타냈으며, 과꽃으로부터 분리된 MBY/L6986 균주의 약1.5배 수준이었다. MBY/L6793 균주의 18s rRNA 유전자의염기서열을 분석한 결과 Hanseniaspora opuntiae로 동정되었으며, 분석된 염기서열은 GenBank (MN859968)에 등록하였다. 40℃에서 배양하였을 때, H. opuntiae MBY/L6793균주는 20 g의 포도당으로부터 3.82 ± 0.98 g의 에탄올을 생산하였으며, 60g의 포도당으로부터 10.05 ± 0.06 g의 에탄올을 생산하여 대조구 균주인 H. opuntiae KCCM50747 균주의 약 2.45배와 5.74배 수준이었다. H. opuntiae MBY/L6793 균주는 한국생물자원센터에 KCTC37025로 기탁하였다.

Following are results of a study on the “Leaders in INdustry-univer-sity Cooperation +” Project, supported by the Ministry of Education and National Research Foundation of Korea and 2015 Research Grant from Kangwon National University (No. 520150114)

The authors have no financial conflicts of interest to declare.

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