Biocatalysis and Bioprocess Engineering | Bioenergy and Biorefinery
Microbiol. Biotechnol. Lett. 2020; 48(2): 179-184
https://doi.org/10.4014/mbl.2003.03003
Jeong-Ah Yoon 1, Young-Eun Do 1, Eun-Hee Park 1, Young-Woo Bae 1 and Myoung-Dong Kim 1, 2*
1Division of Food Biotechnology and Biosystems Engineering, Kangwon National University, Chuncheon 24341, Korea, 2Institute of Fermentation and Brewing, Kangwon National University, Chuncheon 24341, Korea
The MBY/L6793 strain showing the highest ethanol yield of 0.48 ± 0.00 g ethanol/ g glucose was isolated from Senecio cruentus. Its ethanol yield was approximately 1.5 times that of the MBY/L6986 isolated from Callistephus chinensis. The strain was identified as Hanseniaspora opuntiae by sequence analysis of the 18S rRNA gene, and the sequenced gene was registered to the GenBank (MN859968). When grown at 40℃, the strain produced 3.82 ± 0.98 g ethanol from 20 g glucose and 10.05 ± 0.06 g ethanol from 60 g glucose, corresponding to approximately 2.45 and 5.74 times, respectively, compared to the control strain H. opuntiae KCCM50747. The MBY/L6793 strain was deposited to KCTC (Korean Collection for Type Culture) as KCTC37025.
Keywords: Ethanol, yeast, thermotolerance, flower, Hanseniaspora opuntiae
최근 화석연료의 고갈과 원유의 가격상승, 수반되는 환경문제 등으로 인하여 친환경 바이오에너지에 대한 관심이 지속적으로 증가하고 있으며, 전세계적으로 관련 연구가 활발히 진행되고 있다[1, 2].
목질계 바이오매스는 셀룰로스계열의 물질들로 구성되어있어 미생물 발효를 위해서는 전처리공정이 필요하며, 산이나 알칼리를 이용한 화학적 분해방법 또는 cellulase 등의효소를 이용한 가수분해방법이 사용된다[3, 4]. 바이오에탄올을 생산하는 과정에서 동시당화발효(Simultaneous Saccharification and Fermentation)는 분리당화발효(Separate Hydrolysis and Fermentation) 공정보다 상대적으로 시간 및 생산비용 절감 등의 이유로 경제적인 방법으로 평가되지만[5, 6], 당화 온도(45−50℃)와 발효 온도(25− 30℃)의 차이를 극복해야하는 근본적인 문제점이 있다. 따라서, 바이오에탄올을 생산하는데 적합한 균주는 내열성, 내산성, 에탄올 생산성 등의 특성을 갖는 것이 바람직하다[7, 8].
현재까지 토양, 나무 껍질, 썩은 과일, 음식물 쓰레기 등을비롯한 다양한 분리원으로부터 내열성 효모가 분리되었으며[9−11], 일본의 온천지역의 강으로부터 44℃에서 4.0%의 에탄올을 생산하는
다양한 분리원으로부터 분리된 내열성 효모는 40℃ 이상의 온도에서 탄소원의 종류 및 농도, 발효저해제 등에 따른에탄올 생산성을 평가한 연구결과들이 보고된 바 있다[9−11]. Choudhary 등[9]에 따르면 폐수로부터 분리된
본 연구에서는 시네라리아(
강원도 춘천시에서 수집한 6종의 꽃으로부터 효모를 분리하기 위하여 시료 1 ml을 9 ml의 펩톤수에 현탁하여 적정 농도로 희석한 후, chloramphenicol (100 mg/l, Sigma-Aldrich, USA)이 첨가된 YEPD (yeast extract 10 g/l, peptone 20 g/l, glucose 20 g/l, BD Diagnostic, USA) 평판 배지에 도말하였다. 도말한 평판 배지는 30℃에서 48시간 동안 배양하여 단일집락을 확보하였다.
에탄올 생산성이 우수한 효모를 선발하기 위하여 단일집락을 YEPD 배지에 접종하여 30℃에서 12시간 동안 배양하였다. 배양액을 원심분리(5,000 ×
선발된 균주는 YEPD 배지에 접종하여 30℃에서 200 rpm의 교반속도로 24시간 동안 배양한 후 염색체 유전자를 추출하였다[13]. 프라이머 ITS1 (5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3')과 ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3') [18]를 사용하여 18s rRNA 유전자 단편을 증폭한 후 염기서열을 분석하였다. Blast (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)를사용하여 확보한 염기서열과 문헌에 보고된 균주의 염기서열과의 상동성을 비교하여 균주를 동정하였다. 계통수 분석은 MEGA7 (7.0.26, MEGA software, USA) [19] 프로그램의 이웃연결방법(neighbor-joining method) [20]을 사용하여분석하였다. 탄소원에 대한 균주의 탄소원 대사 특성은 API 20C AUX kit (BioMérieux, France)를 사용하여 조사하였다.
균주의 에탄올 생산과 내열성을 평가하기 위하여 단일집락을 YEPD 배지에 접종하여 30℃에서 배양한 후, 원심분리를 통해 회수된 균체를 멸균 증류수로 3회 세척하여 포도당이 2% 및 6% 농도로 첨가된 YEPD 배지에 세포 흡광도가1.0이 되도록 접종하고 30℃ 및 40℃에서 배양하였다.
포도당 및 에탄올 농도는 Rezex ROA-Organic Acid H+ (Phenomenex, USA) 컬럼과 굴절률 검출기(Shimadzu, Japan)가 장착된 High Performance Liquid Chromatography (Shimadzu)를 이용하여 측정하였다. 이동상으로서 0.005 N의 황산용액(H2SO4)을 0.6 ml/min의 유속으로 흘려주었으며, 컬럼온도는 65℃로 유지하였다. 모든 측정은 3회 이상반복하였으며, SPSS Statistics (v22, IBM, USA)를 이용하여 Duncan의 다중범위 검정법[21]으로 유의성을 검정하였다.
강원도 춘천에서 수집한 꽃으로부터 160점의 효모를 분리하였다. 포도당이 10% 농도로 첨가된 YEPD 배지를 사용하여 30℃에서 48시간 동안 배양하였을 때, 에탄올 생산양과수율이 우수한 7점을 선발하여 에탄올 생산 수율을 조사하였다(Fig. 1). 시네라리아 꽃에서 분리한 MBY/L6793 균주는0.48 ± 0.00 g ethanol/g glucose로 가장 높은 에탄올 생산 수율을 나타냈다. 과꽃(
Goshima 등[22]의 연구에 따르면 2%의 포도당이 첨가된YEPD배지에서 24시간 동안 배양한 경우
MBY/L6793 균주의 18S rRNA 유전자의 염기서열을 분석하여 동정하였다. MBY/L6793 균주는
Table 1 . Characteristics of carbohydrate utilization by
Characteristics | ||
---|---|---|
Control | - | - |
Glucose | + | + |
Glycerol | - | - |
2-Keto-D-Gluconate | + | + |
L-Arabitol | - | - |
D-Xylose | - | - |
Adonitol | - | - |
Xylitol | - | - |
D-Galactose | - | - |
Inositol | - | - |
D-Sorbitol | - | - |
α-Methyl-D-glucoside | - | - |
N-Acetyl-glucosamine | - | - |
D Cellobiose | + | + |
D-Lactose | - | - |
D-Maltose | - | - |
D-Saccharose | - | - |
D-Trehalose | - | - |
D-Melezitose | - | - |
D-Raffinose | - | - |
+, positive; -, negative.
Table 2 . Effects of temperature on the growth and ethanol production by
Temperature (℃) | Glucose (%) | Cell growth (OD600) | Ethanol concentration (g/l) | Ethanol production rate (g/l·h) | Ethanol yield (g ethanol/g glucose consumed) | |
---|---|---|---|---|---|---|
30 | 2 | KCCM50747 | 13.60 ± 0.33 | 8.91 ± 0.15 | 1.11 ± 0.02 | 0.46 ± 0.00 |
MBY/L6793 | 16.13 ± 0.74 | 8.31 ± 0.31 | 0.69 ± 0.01 | 0.45 ± 0.00 | ||
6 | KCCM50747 | 18.60 ± 0.40 | 26.69 ± 0.41 | 3.34 ± 0.05 | 0.43 ± 0.00 | |
MBY/L6793 | 22.00 ± 0.75 | 27.93 ± 0.31 | 3.49 ± 0.04 | 0.46 ± 0.01 | ||
40 | 2 | KCCM50747 | 2.72 ± 0.10 | 1.56 ± 0.10 | 0.20 ± 0.01 | 0.27 ± 0.00 |
MBY/L6793 | 3.01 ± 0.09 | 3.82 ± 0.98 | 0.48 ± 0.12 | 0.30 ± 0.06 | ||
6 | KCCM50747 | 2.60 ± 0.10 | 1.75 ± 0.25 | 0.11 ± 0.02 | 0.22 ± 0.05 | |
MBY/L6793 | 4.48 ± 0.17 | 10.05 ± 0.06 | 0.63 ± 0.00 | 0.37 ± 0.01 |
본 연구를 통하여 시네라리아 꽃으로부터 분리한
다양한 꽃으로부터 분리된 160점의 효모 균주 중 시네라리아 꽃에서 분리된 MBY/L6793은 0.48 ± 0.00 g ethanol/g glucose 으로 분리된 균주 중 가장 우수한 에탄올 생산 수율을 나타냈으며, 과꽃으로부터 분리된 MBY/L6986 균주의 약1.5배 수준이었다. MBY/L6793 균주의 18s rRNA 유전자의염기서열을 분석한 결과
Following are results of a study on the “Leaders in INdustry-univer-sity Cooperation +” Project, supported by the Ministry of Education and National Research Foundation of Korea and 2015 Research Grant from Kangwon National University (No. 520150114)
The authors have no financial conflicts of interest to declare.
박종경, 백승윤, 유영제
Microbiol. Biotechnol. Lett. 1989; 17(6): 619-623 https://doi.org/10.4014/mbl.1989.17.6.619Jeong Ah Yoon, Se Young Kwun, Seong Wook Cho, Eun Hee Park, Young Ho Seo, and Myoung Dong Kim
Microbiol. Biotechnol. Lett. 2024; 52(1): 37-43 https://doi.org/10.48022/mbl.2310.10016Hong-Yeoul Ryu
Microbiol. Biotechnol. Lett. 2020; 48(4): 423-428 https://doi.org/10.48022/mbl.2009.09004