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Microbiology and Biotechnology Letters

보문(Article)

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Molecular and Cellular Microbiology (MCM)  |  Microbiome

Microbiol. Biotechnol. Lett. 2022; 50(1): 135-146

https://doi.org/10.48022/mbl.2202.02001

Received: February 3, 2022; Revised: February 18, 2022; Accepted: February 19, 2022

생쥐 비만모델에서 Weissella confusa WIKIM51 식이에 따른 지방합성 및 에너지 대사 조절로 인한 체지방 감소 효과

Oral Administration of Weissella confusa WIKIM51 Reduces Body Fat Mass by Modulating Lipid Biosynthesis and Energy Expenditure in Diet-Induced Obese Mice

Seul Ki Lim1, Jieun Lee2, Sung Soo Park3, Sun Yong Kim4, Sang Min Park4, Ji Ye Mok4, Hyunah Chang4, and Hak-Jong Choi3*

1Fermentation Regulation Technology Research Group, World Institute of Kimchi, Gwangju 61755, Republic of Korea , 2Industrial Solution Research Group, World Institute of Kimchi, Gwangju 61755, Republic of Korea, 3Kimchi Functionality Research Group, World Institute of Kimchi, Gwangju 61755, Republic of Korea, 4Pharmsville Co., Ltd., Seoul 07793, Republic of Korea

Correspondence to :
Hak-Jong Choi,        hjchoi@wikim.re.kr

Abstract

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Obesity is closely associated with profound dyslipidemia, insulin resistance, and fatty liver disease. Recent reports have suggested that alterations in gut microbiota can be linked to diet-induced obesity. In this study, the anti-obesity effects of Weissella confusa WIKIM51 isolated from kimchi were investigated, as evidenced by: i) reduced lipid accumulation and downregulated adipogenesis-related genes in 3T3-L1 adipocytes; ii) suppressed gains in body weight and epididymal fat mass; iii) reduced serum lipid levels, for example, triglyceride and total cholesterol; iv) increased serum adiponectin levels and reduced serum leptin levels; v) downregulated lipogenesis and upregulated β-oxidation-related genes in the epididymal fat; and vi) altered microbial communities. The collective evidence indicate the potential value of W. confusa WIKIM51 as a functional food supplement for the prevention and amelioration of obesity.

Keywords: Weissella confusa, lactic acid bacteria, anti-obesity activity, Kimchi

Graphical Abstract


서 론

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현대사회에서 비만은 흔한 질환이지만, 대사증후군, 고혈압, 심장병, 암, 수면장애 등의 합병증을 유발할 수 있는 심각한 건강문제로 전 세계의 공중 보건을 위협하고 있다[1]. 비만은 만성적인 잉여 에너지가 체지방의 형태로 축적되는 현상으로 단순하게 체중이 증가하는 것이 아닌 지방세포의 과도한 증식 및 분화를 야기함으로써 체중이 증가된 상태를 말한다[2]. 체내 지방의 축적을 유발하는 환경적 요인 중에는 고지방 및 고단백 식이를 하는 서구화된 식·생활 습관이 주요원인으로 간주되고 있다[3, 4].

최근, 차세대 염기서열분석(NGS) 기술의 발전으로 인체에 존재하는 미생물에 대한 많은 연구가 진행되고 있으며, 비만과 장내 마이크로바이옴의 관련성을 입증하려는 연구 또한 활발하게 진행되고 있다. 장내 마이크로바이옴은 숙주의 식생활과 밀접하게 연관되어 있으며, 비만은 장내 미생물의 군집 및 기능의 변화를 초래하여 장내 미생물 불균형(dysbiosis)으로 이어질 수 있다고 보고되고 있다[5, 6]. 실제로 비만 마우스의 장내 미생물을 정상 또는 무균 마우스에 이식하자 체중 증가 및 대사 장애가 발생하였으며, 이는 장내 미생물이식이 에너지 이용과 지방 및 간 조직의 지방산 대사 조절과 관련이 있다고 보고되고 있다[7−10]. 따라서 장내 미생물 군집의 조절은 비만 개선에 있어 대사 장애에 대해 독성이 없고, 안전한 잠재적 치료법이 될 수 있다.

프로바이오틱스(probiotics)란, 사람을 포함한 동물의 위장관 내에서 숙주의 장내 미생물 환경을 개선하여 숙주의 건강에 유익한 영향을 주는 살아있는 미생물을 의미한다[11]. 프로바이오틱스의 유익한 효과는 장내 균총의 개선, 정장작용, 항비만, 항암, 면역활성 등이 보고되고 있음에도 불구하고 프로바이오틱스에 대한 전반적인 이해는 부족한 실정이다[11−14].

김치는 다양한 원부재료와 부재료로 만든 한국의 전통 발효 식품이다. 특히, 김치의 발효는 다양한 유산균에 의해 이루어지며[15], 그 중 Weissella는 초기 또는 중기 발효단계에서 다량 존재하는 우점균이다[16, 17]. Weissella 속의 유산균의 정장작용 및 면역 증강 효과는 이미 잘 알려져 있으나[18−20], 비만 관련 연구는 매우 미비한 실정이다.

따라서, 본 연구는 고지방식이로 비만을 유도한 동물실험을 통해 김치 유래 유산균 Weissella confusa WIKIM51이 지질대사에 미치는 영향을 통해 항비만 효과를 평가하였다. 그 결과, W. confusa WIKIM51은 고지방식이로 유도된 체중 증가, 부고환 지방의 축적, 지방 대사 관련 유전인자의 발현을 억제하였으며, 비만으로 인한 장내 미생물의 불균형이 개선되는 효과를 확인하였다.

재료 및 방법

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Weissella confusa WIKIM51 유산균 분리 및 준비

민들레 김치 유래 W. confusa WIKIM51은 한국미생물보존센터에 미생물 특허기탁(KCCM11914P) 되어 있으며, 본 실험에 사용된 W. confusa WIKIM51은 식품 및 식품 첨가물 공전에 등록된 개별 조성물을 이용한 혼합배지에 전 배양과 본 배양을 거쳐 회수된 균체를 동결건조 보호제와 혼합하여 동결건조 한 분말을 4℃에서 보관하며 실험에 이용하였다.

3T3-L1 전지방세포주의 배양 및 분화유도

3T3-L1 전지방세포주를 10% calf serum (CS)와 100 unit/ml의 페니실린과 100 ng/ml의 스트렙토마이신을 함유한 Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM, Gibco, USA) 배양액을 사용하여 37℃에서 5% CO2가 유지되는 배양기에서 배양하였다. 이때 배지를 교환할 때마다 phosphatebuffered saline (PBS) 용액을 사용하여 세포표면을 세척하였고, 신선한 10% CS 배지를 포함하는 DMEM 배양액으로 교환하였다. 세포가 단일층으로 플라스크 바닥에 80% 정도 부착하면 PBS 용액을 사용하여 세포표면을 세척하여, 0.25% trypsin-EDTA (Gibco) 용액을 첨가한 뒤 원심분리 하였다. 이들 세포를 6-well plate에 1 × 105 cells을 균등하게 분주하였으며, 10% fetal bovine serum (FBS)와 100 unit/ml의 페니실린과 100 ng/ml의 스트렙토마이신을 함유한 DMEM 배양액을 사용하였다. 100% confluent stage 2일 후, 10% FBS를 함유한 DMEM 배양액에 adipogenic cocktail인 dexamethasone 0.05 μM, IBMX 0.25 mM, 인슐린 2 μg/ml이 함유된 배양액으로 교환하여 3일 분화를 유도하였다. 3일 후 배양액 교환 시 5 μg/ml 인슐린만을 포함하는 10% FBS를 함유한 DMEM 배양액으로 3일간 처리하였고, 마지막 3일간은 10% FBS를 함유한 DMEM 배양액을 사용하였다.

지질 축적량 측정(Oil Red O staining)

시료들이 지방분화과정에서 지방축적(lipid accumulation) 정도에 미치는 효과를 알아보기 위해 Oil Red O 염색을 실시하였다[21]. 100% confluent stage 2일 후, adipogenic cocktail 첨가 배양액, insulin 첨가 배양액, FBS 배양액 교환 시, 시료들을 농도별로 처리하였으며, 9일의 분화 후 배양액을 제거하고 PBS로 세척한 다음 10% 포름알데히드로 10분간 고정시켰다. 10% 포름알데히드를 제거하고 다시 포화된 포름알데히드를 넣어 1시간 이상 세포를 고정시켰다. 그 후 60% isopropanol을 넣고 바로 제거한 후 증류수로 세척하고 Oil Red O 염색용액으로 30분간 지방구를 염색한 후 증류수로 세척하였다. 염색된 지방구의 세포 내 지방축적을 현미경을 이용하여 관찰하였으며 사진촬영을 통해 육안적으로 시료들이 지방분화 시 지방축적에 미치는 영향을 관찰하였다. 축적된 지방 확인을 위해 잘 건조된 상태에서 isopropanol을 첨가하여 Oil Red O dye를 용출한 뒤 multiplate reader를 사용하여 500 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 isopropanol을 blank로 사용하였다.

3T3-L1 지방세포 및 조직 내 유전자 발현 측정(Real-time PCR)

Real-time PCR 방법을 통해 유전자 발현을 측정하였다. 3T3-L1 지방세포 및 지방 조직 내 total RNA는 Trizol reagent (Invitrogen, USA)를 사용하여 분리하고, UV/visible spectrophotometer를 이용하여 정량하였다. 각각의 분리된 RNA 1 μg을 TOPscriptTM cDNA Synthesis kit (Enzynomics, Korea)와 S1000 Thermal Cycler (Bio-Rad, USA)을 사용하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA를 각각의 primer (Table 1), nuclease-free water, TOPrealTM qPCR 2x PreMIX (SYBR Green)를 넣고 BioRad CFX-96 Real Time System (Bio-Rad)을 이용하여 증폭하였다. Realtime quantitative PCR의 조건으로서: initial denaturation은 95℃에서 10분, 그리고 40 cycles을 95℃에서 10초, 55℃에서 10초, 72℃에서 30초간 수행하였다.

Table 1 . List of oligonucleotide primer pairs used in real time RT-PCR.

GeneSenseAntisense
aP25-ACGAACTGTGACCTGGAGAG-3'5'-CTTCCGAGCATCCAGATAGA-3'
C/EBPα5'-TGCTCTGATTCTTGCCAAA-3'5'-ACCCAAAATCCCTAAACC-3'
Cpt15'-ACCCTGAGGCATCTATTGACAG-3'5'-ATGACATACTCCCACAGATGGC-3'
Fas5'-TGTTCCTTGTGCACCCCATT-3'5'-GTAGGTGTGTGAGCCGTCAA-3'
Dagt15'-GTGCCATCGTCTGCAAGATTC-3'5'-GCATCACCACACACCAATTCAG-3'
Dagt25'-TTCCTGGCATAAGGCCCTATT-3'5'-CCTCCAGACATCAGGTACTCG-3'
Pgc1α5'-GAAACTTTGGAGGCCAGCA-3'5'-CGCCATCCCTTAGTTCACTGG-3'
Pparα5'-CTGCAGAGCAACCATCCAGAT-3'5'-GCCGAAGGTCCACCATTTT-3'
Pparγ5'-GCCCTTTGGTGACTTTATGGA-3'5'-GCAGCAGGTTGTCTTGGATG-3'
Scd15'-CCTCCGGAAATGAACGAGAGAA-3'5'-CCTGATAGGTGGGGTCGTGA-3'
β-actin5'-GTTACCACTGGGACGAC-3'5'-CTCAAACATGATCTGGGTCA-3'


실험동물 사육 및 식이

본 연구에서 수행된 동물실험은 세계김치연구소 동물윤리위원회의 승인을 받아 진행하였다(WIKIM IACUC 202034). 실험동물은 생후 5주령의 수컷 C57BL/6 마우스를 ㈜오리엔트바이오(Korea)에서 구입하였다. 상업용 고형사료로 7일간 사육환경에 적응시킨 후, 정상식이군(ND), 고지방식이 대조군(HFD), W. confusa WIKIM51 1 × 109 CFU 섭취군, W. confusa WIKIM51 1 × 1010 CFU 섭취군 총 4개의 군으로 분리하였다(Table 2). 실험동물은 물과 실험식이를 자유롭게 섭취하도록 하였고, 실험식이는 Research Diets (New Brunswich, USA)의 AIN-95 식이를 변형하여 정상식이 (Normal diet, ND; 10% fat kcal)와 고지방식이(High fat diet, HFD; 45% fat kcal)를 구입하여 섭취하도록 하였다. 실험동물에 적용한 유산균 W. confusa WIKIM51은 매일 PBS에 현탁하여 경구투여하면서 10주간 사육하였다. 실험 환경은 온도 22 ± 1℃, 습도 50 ± 5%로 유지하였고, 12시간 명암 주기로 일정하게 유지되는 동물 사육실에서 수행하였다.

Table 2 . Experimental design.

GroupsDiet composition
NDNormal diet
HFD45% High fat diet
Supplement45% High fat diet + Supplement without Weissella confusa WIKIM51
WIKIM51(9)45% High fat diet + Weissella confusa WIKIM51 1 × 109 CFU
WIKIM51(10)45% High fat diet + Weissella confusa WIKIM51 1 × 1010 CFU


체중 및 사료 섭취량 측정

체중은 주 1회 일정한 시간에 측정하였으며, 예비사육 직후의 체중을 초기(initial) 체중으로 하고 10주 후의 체중을 마지막(final) 체중으로 하여 체중 증가량을 계산하였다. 식이는 주 2회 동일한 시간에 공급하였고, 전에 남은 사료의 양과 새로 공급한 사료의 양을 측정하여 그 차이로 사료 섭취량을 계산하였다.

해부 및 장기 무게 측정

실험 종료 전, 실험동물은 최소 12시간 절식시킨 후 CO2 가스 흡입 안락사 방법으로 희생하였다. 복부를 개복한 다음, 하대정맥에서 채혈하였다. 채혈된 혈액은 2,500 rpm에서 20분간 원심분리하여 혈청을 분리한 뒤 실험에 사용하였다. 간, 부고환 지방은 적출하여 생리 식염수에 세척하고, 여과지로 수분을 제거한 후, 중량을 측정하였다. 혈청 및 조직은 분석 직전까지 -80℃ deep freezer에 보관하였다.

혈청 생화학적 분석

혈청 중의 total cholesterol (TC), triglyceride (TG), glucose (Glu), glutamic oxaloacetic transaminase (GOT), glutamic pyruvic transaminase (GPT), BUN은 자동 생화학 측정기(FUJI DRI-CHEM 7000i, Fujifilm, Japan)를 이용하여 측정하였다.

혈청 Adipokine 분석

혈청 중의 adipokine인 adiponectin, leptin, insulin의 함량은 Bio-Plex Pro Mouse Diabetes Assay 8-plex (Bio-rad)를 사용하여 Bio-Plex MAGPIX Multiplex Reader에서 측정하였다.

조직학적 분석

부고환 지방을 적출하여 생리식염수로 세척하고, 10% 중 성포르말린에 고정하였다. 고정된 조직은 파라핀 블록을 제작하여 5 μm 두께로 절편하고, hematoxylin과 eosin (H&E) 염색을 실시하였다. 염색된 부고환 지방조직은 광학현미경 (200×; Olympus DP 73)으로 관찰되었다.

장내 미생물 군집 분석

맹장을 적출한 후, 액제질소에 급속 동결시켜 -150℃에 보관하였다. Genomic DNA는 FastDNA Spin Kit (MP Biomedicals, USA)를 이용하여 추출하고, 16S rRNA 유전자의 V3-V4 영역을 증폭하였다. 증폭된 PCR 산물은 QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen, USA)를 이용하여 정제하고, 250 bp 이상의 DNA가 선별되었다. Illumina MiSeq (Illumina, USA) 장비를 사용하여 염기서열 정보를 확보하였으며, EzBioCloud software (Chunlab, Inc., Korea)를 이용하여 분석하였다.

통계처리

모든 분석결과는 GraphPad Prism (Version 6.0, GraphPad Software Inc., USA)을 이용하여 평균 ± 표준편차로 표시하였고, 각 군간의 통계적 유의성 검증은 one-way ANOVA를 이용하여 분석하였다. 장내 미생물과 비만 관련 지표 사이의 상관관계는 Pearson을 이용하여 분석하였다. 실험군 간의 유의성은 p < 0.05, p < 0.01, 그리고 p < 0.001 수준에서 검증하였다.

결과 및 고찰

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3T3-L1 전지방세포의 지질 축적에 미치는 영향

3T3-L1 전지방 세포가 지방세포로 분화됨에 있어 W. confusa WIKIM51 유산균의 지방세포 분화에 미치는 영향을 알아보았다(Fig. 1). WIKIM51 유산균은 2.5 × 107−1 × 108 CFU/well 용량으로 처리하였으며, 지방세포 분화를 유도한 후 Oil red O 염색법을 이용하여 지방 축적 정도를 측정하였다. 그 결과, 대조군 대비 WIKIM51 처리군에서 각각 약 60%, 78%, 그리고 80% 이상의 지방축적 억제능을 확인하였다(Figs. 1A and B).

Figure 1.Adipogenesis inhibitory effect of W. confusa WIKIM51 in preadipocyte 3T3-L1 cells. (A) Lipid accumulation (%) dissolved with 100% isopropyl alcohol, (B) Lipid droplet staining with Oil-red-O solution. (C) mRNA levels of Pparγ, C/EBPα, Srebp-1c, Fas, Scd1, Dgat1, and Dgat2 determined by real-time PCR. The level of significance was measured using ANOVA. Dunnett’s multiple comparisons test was used to distinguish the level of significance based on probability of 0.05 (*), 0.01 (**) and <0.001 (***) compared to the control.

전지방 세포에서 지방세포로 분화하는 과정에는 지방 축적에 의한 지방구 생성의 형태학적 변화뿐만 아니라 지방세포 분화와 관련된 인자들의 발현이 나타난다. 지방축적을 억제하는 메커니즘을 이해하기 위해 지방 분화에 관여하는 전사인자인 peroxisome proliferator-activated receptor-γ (Pparγ), CCAAT/enhancer-binding protein-α (C/EBPα), sterol regulatory element-binding protein-1c (Srebp-1c), adipocyte protein 2 (aP2), fatty acid syntheas (Fas), Stearoyl-CoA desaturase1 (Scd1), Type I Diacylglycerol acyltransferase (Dgat1), Type II Diacylglycerol acyltransferase (Dgat2)의 mRNA 발현을 분석하였다. 그 결과, 지방세포를 분화시킨 대조군 대비 WIKIM51 처리군의 지방세포에서 발현하는 지방 대사 관련 유전자의 발현이 유의적으로 감소되었으며, 용량에 의존적인 양상을 보였다(Fig. 1C). 이를 통해 W. confusa WIKIM51은 주요 유전자들의 발현을 억제함으로써 세포 내 지질 축적을 감소시킬 수 있었던 것으로 판단되어진다.

체중증가 및 식이 섭취량에 미치는 영향

3T3-L1 지방세포에서 지질 축적을 감소시키는 W. confusa WIKIM51의 in vitro 결과를 바탕으로 고지방식이로 유도된 비만 마우스 실험모델을 이용하여 항비만 효능을 평가하였다. 실험동물은 고지방식이를 공급하여 비만을 유도함과 동시에 W. confusa WIKIM51 유산균(in vitro 실험에서 사용한 것과 동일한 제제)의 생균수가 다른 2개의 군을 설정하여, 1 × 109 CFU/head/day (WIKIM51(9))와 1 × 1010 CFU/head/day (WIKIM51(10))의 용량으로 경구투여 하였다(Table 2). W. confusa WIKIM51이 체중증가 및 식이섭취량에 미치는 영향을 확인하기 위해 10주간 고지방식이를 공급하며 관찰하였다(Fig. 2). 그 결과, 고지방식이군(HFD) 보다 유산균 WIKIM51 섭취군에서 체중 증가량이 유의적으로 감소되었음을 확인할 수 있었다. 하지만, 용량을 달리한 W. confusa WIKIM51을 경구 투여한 군 간의 유의적인 차이는 보이지 않았다. 군 간의 식이 섭취량은 모든 군에서 차이를 보이지 않았으며, 이는 체중증가 억제 효능이 식이 섭취량 감소에 기인한 것이 아님을 나타낸다. 이 결과는 W. confusa WIKIM51의 섭취가 체중 증가를 억제할 수 있는 체중 조절제로서의 가능성이 있음을 시사한다.

Figure 2.Anti-obesity effect of W. confusa WIKIM51 determined in a diet-induced obesity (DIO) mouse model. The oral administration effects of W. confusa WIKIM51 on body weight change (A) and body weight gain (B) are shown. Food intake (C) and total food intake (D) were monitored. Histological analysis of epididymal fat (G) was demonstrated using H&E staining (magnification= 200×, scale bar, 50 μm). Values are presented as the mean ± SD (n = 5-6 per group). *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 vs HFD. Feeding groups: ND, low-fat diet; HFD, high-fat diet; Supplement, high-fat diet plus supplement without WIKIM51; WIKIM51(9), high-fat diet plus WIKIM51 1 × 109 CFU; WIKIM51(10), high-fat diet plus WIKIM51 1 × 1010 CFU.

혈중 지질 및 간 기능 지표에 미치는 영향

장기간의 고지방식이는 비정상적인 지질대사를 하게 되며, 이는 이상지질혈증 및 지방간을 야기하게 된다[22]. 고지방식이에 의해 영향을 받는 혈액 내 중성지방(Triglyceride, TG) 및 총 콜레스테롤(Total cholesterol, TC) 증가는 대표적인 이상지질혈증이며, 혈중 GOT와 GTP는 간기능을 반영하는 지표로 알려져 있다[23]. 10주간의 고지방식이와 W. confusa WIKIM51을 급여한 마우스의 혈청 내 지질대사 및 간기능 지표 분석 결과는 Fig. 3에 나타냈다. 정상식이군(ND)에 비해 HFD군의 혈중 TG, TC의 수준이 상당히 증가된 반면, WIKIM51 섭취군에서 유의적인 감소를 확인하였다(Fig. 3A, B). 특히, 혈중 TG의 함량은 ND군과 비슷한 수준까지 감소되었으며, 유산균의 농도 의존적인 양상을 보였다(Fig. 3A). 또한, WIKIM51 섭취군은 혈중 glucose와 간기능 지표인 혈중 GOT와 GPT를 개선시켰다(Fig. 3C−E). 혈중 BUN은 간에서 단백이 분해될 때 생기는 노폐물로, 신장을 통한 제거로 혈중 농도를 조절하게 된다. 즉, 신장 기능의 지표가 되는 혈중 BUN은 모든 군 간의 차이를 보이지 않았다. 이는 10주간의 고지방식이 및 W. confusa WIKIM51의 섭취가 신장기능 이상을 초래하지 않고, 체중 증가 억제 효능을 나타내는 것으로 사료된다(Fig. 3F).

Figure 3.Effects of W. confusa WIKIM51 intake on serum biochemical parameters. Values are presented as the mean ± SD (n = 5-6 per group). *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 vs HFD. Feeding groups: ND, low-fat diet; HFD, high-fat diet; WIKIM51(9), high-fat diet plus WIKIM51 1 × 109 CFU; WIKIM51(10), high-fat diet plus WIKIM51 1 × 1010 CFU.

부고환 주위 복부내장지방에 미치는 영향

고지방식이를 통하여 비만을 유도한 C57BL/6 마우스에 W. confusa WIKIM51을 경구 투여했을 때, 부고환지방의 무게에 미치는 영향을 확인하였다. 부고환지방의 무게는 HFD군과 비교하였을 때, W. confusa WIKIM51섭취에 따라 유의적인 차이로 감소되었다(Fig. 4A). 적출한 부고환 지방조직을 고정하여 hematoxylin & eosin (H&E) 염색을 통하여 지방의 형태학적 관찰을 수행한 결과는 Fig. 4B와 같다. 정상식이를 한 ND군에 비해 고지방식이를 한 HFD군에서 부고환 지방세포의 크기가 커진 반면, WIKIM51 섭취군에서는 ND군과 유사하게 지방세포의 크기가 감소한 경향을 보였다.

Figure 4.Effects of W. confusa WIKIM51 intake on epididymal fat tissue. The effect of W. confusa WIKIM51 intake on epididymal fat weight (A) and histological change of epididymal fat (B) are shown. Histological analysis of epididymal fat was demonstrated using H&E staining (magnification= 200×, scale bar, 50 μm). Effects of administering W. confusa WIKIM51 on the transcription of genes related to lipid metabolism (C and D) in epididymal fat tissue. Values are presented as the mean ± SD (n = 5-6 per group). *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 vs HFD. Feeding groups: ND, low-fat diet; HFD, high-fat diet; WIKIM51(9), high-fat diet plus WIKIM51 1 × 109 CFU; WIKIM51(10), high-fat diet plus WIKIM51 1 × 1010 CFU.

고지방식이에 의해 유도된 부고환지방의 증가를 억제하는 메커니즘을 이해하기 위해 부고환 지방 형성 과정에 관여하는 지질대사 관련 주요 전사조절인자인 Pparγ, C/EBPα, Srebp-1c, Fas, 그리고 aP2의 mRNA 발현을 분석하였다. 그 결과, ND군 대비 HFD군의 부고환 주위 복부내장지방에서 발현하는 지방 대사 관련 유전자의 발현이 유의적으로 증가되었다(Fig. 4C). 반면, WIKIM51 섭취에 따라 지방산 합성에 관련된 Pparγ, C/EBPα, Srebp-1c, 그리고 Fas의 발현이 유의적으로 감소되었으며, WIKIM51 유산균 섭취 농도의존적인 양상을 보였다. 또한, 지방세포에서 주로 발현되는 지방산의 운반 단백질인 aP2 및 β-산화(β-oxidation)에 관련된 Pgc1a, Pparα, 그리고 Cpt1의 발현이 유의적으로 개선되었다(Fig. 4D). 실제로 지방세포에서 분비되는 지방대사, 에너지 항상성 및 인슐린 감수성 조절을 통해 비만 관련 대사 질환의 주요 영향인자로 알려진 adipokine 및 endocrine 호르몬의 수준을 확인한 결과, WIKIM51 섭취군의 혈중 adiponectin, leptin, 및 insulin의 함량이 HFD군에 비해 유의적인 개선 효과를 보였다(Fig. 5). 이 결과는 앞서 보았던 W. confusa WIKIM51 섭취군에서 혈청 내 지질함량의 수준이 감소된 효과와 일치하며, 유산균의 섭취가 지질 대사 관련 유전자의 발현 조절 및 에너지 대사 활성을 통해 지방축적을 억제하는 것으로 사료된다.

Figure 5.Effects of W. confusa WIKIM51 intake on adipokine and endocrine hormones. Values are presented as the mean ± SD (n = 5-6 per group). *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 vs HFD. Feeding groups: ND, low-fat diet; HFD, high-fat diet; WIKIM51(9), high-fat diet plus WIKIM51 1 × 109 CFU; WIKIM51(10), high-fat diet plus WIKIM51 1 × 1010 CFU.

장내 미생물군집 변화에 미치는 영향

인체 내에 존재하는 미생물 중 약 95% 미생물이 위장관 내에 서식하고 있으며, 숙주의 식생활에 영향을 받아 비만과 같은 대사질환은 장내 미생물 군집의 불균형을 일으키게 된다[24]. 따라서 고지방식이에 의해 유도된 장내 미생물 군집의 불균형 개선 효과를 평가하기 위해 항비만 효능이 가장 뛰어난 WIKIM51(10) 섭취군의 맹장(cecum) 내 미생물군집 분석을 수행하였다. 군당 5마리의 마우스에서 총 805,627개의 염기서열이 얻어졌으며, 마우스 개체당 평균 53,708개의 염기서열을 얻었다(범위 26,497−99,802). 각 군의 alphadiversity는 OTUs와 ACE 지수를 이용하여 확인하였다. W. confusa WIKIM51 섭취 시 종(species)의 풍부도를 나타내는 OTUs와 ACE 지수가 HFD군 대비 ND군 수준으로 개선되었다(Fig. 6A). 반면, 동일 군 내 존재하는 미생물의 종 간 균일성을 나타내는 Simpson 지수는 HFD군과 다르지 않았다. 이는 특정 미생물 종의 증가 및 감소를 반영한다. Betadiversity 분석 결과는 Fig. 6B에 나타냈다. ND군, HFD군, 그리고 WIKIM51 섭취군 모두 각각 먼 거리에 클러스터링되는 것으로 보아, 고지방식이와 W. confusa WIKIM51 섭취에 의해 장내 미생물 군집이 변화한다는 것을 확인할 수 있다. 모든 마우스의 시료는 Firmicutes, Bacteroidetes, Deferribacteres, Proteobacteria 및 others (<1% relative abundance) 총 5개 문(phylum)으로 구성되었으며, Firmicutes (30−69%)와 Bacteroidetes (3−48%)의 비율이 가장 큰 비중을 차지했다(Fig. 6C). 비만 환자에게서 대체로 높은 Firmicutes/Bacteroidetes (F/B) 비율이 보고되고 있는 것과 일치하게 HFD군의 F/B 비율이 ND군에 비해 증가하였으며[25], WIKIM51 섭취군에서 유의적으로 감소하였다(Figs. 6D−F).

Figure 6.Effects of W. confusa WIKIM51 intake on cecal microbiome composition. Bacterial taxonomic profiling at the phylum (C) levels of intestinal bacteria from different groups. The relative abundance of the bacterial phylum (D and E) and Firmicutes to Bateroidetes ratio (F) in the fecal samples from different groups. Values are presented as the mean ± SD (n =5 per group). *p < 0.05, **p < 0.01, ***p< 0.001 vs HFD. Feeding groups: ND, low-fat diet; HFD, high-fat diet; WIKIM51(10), high-fat diet plus WIKIM51 1 × 1010 CFU.

장내 미생물군집과 비만 임상 지표 간의 상관관계 분석

ND군, HFD군, 및 W. confusa WIKIM51 섭취군에서 특이적으로 많은 미생물을 확인하기 위해 linear discriminant analysis (LDA) effect size (LEfSe)를 사용하여 군 간의 차이를 특성화하는 LDA score 2 이상을 나타내는 종을 식별하였다. 군 간의 차이를 보이는 장내 미생물 총 21종(ND군 6종, HFD군 9종, WIKIM51군 6종)을 Fig. 7A에 나타냈다. Bacteroides sartorii, Muribaculum intestinale, Parabacteroides goldsteinii, 그리고 Bacteroides caecimuris의 relative abundance가 HFD군에서 유의적으로 감소된 반면, WIKIM51 섭취군에서 증가되었다. 또한, ND군 대비 HFD군에서 유의적으로 증가된 Desuldesulfo fairfieldensis, Enterorhabdus muris, Lactococcus lactis, Anaerotruncus colihominis의 relative abundance가 W. confusa WIKIM51 섭취군에서 유의적으로 감소되었다(Fig. 7B). 앞서 분석한 비만 임상 지표와 군 간의 차이를 보이는 장내 미생물 21종의 상관관계를 분석한 결과는 Fig. 7A 아래와 같다. ND군에서 증가된 미생물군은 body weight gain (BWt, r = -0.66 ± 0.08), epididymal fat weight (EWt, r = -0.72 ± 0.05), 혈중 TC (r = -0.65 ± 0.08)와 leptin (r = -0.73 ± 0.08)에 음의 상관관계를 나타냈으며, 혈중 adiponectin (r = 0.59 ± 0.04)과는 양의 상관관계를 나타냈다. HFD군에서 증가된 미생물군은 BWt (r = 0.7 ± 0.16), EWt (r = 0.7 ± 0.15), 혈중 TG (r = 0.5 ± 0.23), TC (r = 0.64 ± 0.14), glucose (r = 0.55 ± 0.20), 그리고 leptin (r = 0.68 ± 0.14)에 양의 상관관계를, 혈중 adiponectin (r = -0.66 ± 0.15)과 음의 상관관계를 나타내었다. 마지막으로, W. confusa WIKIM51 섭취군에서 증가된 미생물 중 Bacteroides caecimuris만 BWt (r = -0.81), EWt (r = -0.7), 혈중 TG (r = -0.74), TC (r = -0.6), glucose (r = -0.55), 그리고 leptin (r = -0.75)에 음의 상관관계를, 혈중 adiponectin (r = 0.61)과 양의 상관관계를 나타내었다.

Figure 7.Differentially represented species between ND, HFD, and W. confusa WIKIM51 group through linear discriminant analysis effect size (LEfSe) analysis. Latent Dirichlet allocation (LDA) score indicates the effect size. And the correlation of gut microbiota changes with clinical parameters related to obesity was presented as a heat map analysis. Pearson correlation values were used for the matrix, with red indicating a positive correlation and blue indicating a negative correlation. Values are presented as the mean ± SD (n = 5 per group). *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 vs HFD. Feeding groups: ND, low-fat diet; HFD, high-fat diet; WIKIM51(10), high-fat diet plus WIKIM51 1 × 1010 CFU.

본 연구의 결과를 종합하면, 민들레 김치에서 분리된 W. confusa WIKIM51의 섭취는 지질 생합성 및 에너지 소비 조절을 통해 비만 개선효과를 나타냈으며, 이는 W. confusa WIKIM51이 건강기능식품 후보소재가 될 수 있다는 것을 제시한다.

요 약

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비만은 지질대사 불균형으로 인한 이상지질혈증과 밀접한 관련이 있으며, 장내 미생물의 군집 및 기능의 변화를 유도하여 장내 미생물 불균형을 초래할 수 있다. 본 연구에서는 민들레 김치에서 분리한 김치 유래 유산균 W. confusa WIKIM51의 항비만 효능을 in vitro와 in vivo에서 평가하였다. 먼저, WIKIM51은 지방세포 분화를 유도한 3T3-L1 세포에서 지방대사 관련 유전자의 발현 조절을 통해 지방구 생성을 억제하였다. 후천적 비만 동물 모델을 이용한 in vivo 실험에서 10주간 W. confusa WIKIM51의 경구 투여는 고지방식이에 의해 유도된 체중 증가를 현저히 감소시켰다. 특히, 부고환 주위 지방량, 조직학적 분석을 통한 지방구의 크기 및 혈중 지표인 TG, TC, adiponectin, 그리고 leptin의 수준이 HFD군에 비해 W. confusa WIKIM51 섭취군에서 유의적으로 개선되었다. 또한 W. confusa WIKIM51 섭취군은 Pparγ, C/EBPα, Srebp-1c, Fas와 같은 지방 생성 및 지방산 합성 관련 유전자의 발현을 억제하였고, 반면 에너지 소비 관련 유전자 Pparα와 Cpt1의 발현은 증가시켰다. 더 나아가, W. confusa WIKIM51은 고지방식이로 인해 유도된 Firmicutes/Bacteroidetes 비율을 정상식이군의 수준으로 감소시켜 장내미생물의 불균형을 개선시켰다. 이러한 결과들을 종합해 볼 때, W. confusa WIKIM51의 섭취는 고지방식이로 인한 지방 축적을 억제하여 효과적으로 비만을 개선할 수 있으며, 이는 항비만 기능성 소재 및 식품 개발로의 활용이 가능함을 제시한다.

Acknowledgments

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This work was supported by the Technology development Program (S2844004) funded by the Ministry of SMEs and Startups (MSS, Korea).

Conflict of Interest

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The authors have no financial conflicts of interest to declare.

References

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