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Microbiology and Biotechnology Letters

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Fermentation Microbiology  |  Applied Microbiology

Microbiol. Biotechnol. Lett. 2020; 48(3): 337-343

https://doi.org/10.4014/mbl.2004.04009

Received: April 22, 2020; Accepted: June 23, 2020

혼합영양 조건하에서 Haematococcus sp.의 배지 최적화 및 대사산물 생산

Medium Optimization for Cell Growth and Metabolite Formation from Haematococcus sp. under Mixotrophic Cultivation

Hyo Seon Kim , Sung-Koo Kim and Gwi-Taek Jeong *

Pukyong National University, Republic of Korea

Abstract

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In this study, the medium optimization for cell growth and metabolite formation of Haematococcus sp. under mixotrophic cultivation was investigated. As a result, modified MS medium was selected as the basal medium; glucose was selected as the carbon source, with an optimum concentration of 10 g/l, and potassium nitrate was chosen as the nitrogen source, with an optimum concentration of 1.9 g/l. Under optimum conditions, Haematococcus sp. demonstrated an increase in biomass concentration from 0.18 gDW/l to 5.58 gDW/l in 14 days, after which there was a 31-fold increase in its growth. At the same time, the concentrations of chlorophyll and carotenoids were 172.16 mg/l and 42.33 mg/l, respectively. This work will contribute to the basic data for mass cultivation of microalgae.

Keywords: Haematococcus sp., mixotrophic cultivation, medium optimization, chlorophyll;, carotenoids

서론

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해조류와 미세조류는 광합성을 하는 엽록소를 가진 식물이며, 광합성을 통해 빛에너지를 얻어 이산화탄소를 탄소원으로 사용하는 독립영양 생물이다. 미세조류는 물속에서 성장하여 육상식물과 경작지를 경쟁하지 않으며, 다른 바이오매스에 비해 성장 속도가 빠르고, 이산화탄소 흡수율이 높다는 장점이 있다[1]. 미세조류를 이용한 산업적 응용 분야로는 폐수처리, CO2 고정화, 양식 사료, 건강식품 소재, 생리활성물질 생산, 가공용 소재, 의약품 소재 등으로 매우 다양하다[2−5]. 미세조류는 다양한 분야에서 이용될 수 있으나,생물 소재로서는 바이오매스 자체의 이용 즉, 단백질이나 지방질을 식량자원으로 이용하는 것이고, 다른 하나는 미세조류가 함유 또는 생산하는 생리활성물질이나 기능성 물질을이용하는 분야로 나눌 수 있다. 미세조류는 세포 내에 단백질, 색소 등과 같은 산업적으로 이용 가능한 생리 기능 물질을 많이 함유하고 있고, 유용물질을 생산하는 생물 산업 소재로써 활용될 수 있다. 특히 미세조류는 영양보충제나 천연색소 등으로 건강보조식품으로 사용되며 뿐만 아니라, 의약원료 물질, 생리활성물질 등 의약용 물질로 사용된다[6]. 미세조류의 이러한 장점에도 산업적으로 미세조류의 이용이더딘 이유는 고농도, 대량배양의 어려움이 있기 때문이다. 미세조류의 고농도, 대량배양을 위해서는 많은 연구가 수행되어야 하며, 적합한 광 생물 반응기를 설계하거나 배양액 외에도 여러 가지 영향 인자들을 충분히 고려해야 한다. 더불어 미세조류의 배양 시에는 조류의 생장 및 생산 가능 물질의 특성을 잘 고려하여야 한다[6].

안전하고 건강기능성 물질을 함유한 식품에 많은 관심이있는 최근 소비자들은 자연에서 얻을 수 있는 식품 소재 중에서 식물성 식품에서 유래한 식물성 화학물질(파이토케이컬)인 색소 물질에 관한 관심이 증가하고 있다[6, 7]. 색의 종류가 다양하나 인체에 독성이나 발암성을 가지고 있는 합성색소와 달리 식물체에서 유래한 천연 색소 물질은 비타민,미네랄, 폴리페놀 화합물을 비롯한 여러 가지 생리활성을 나타내는 성분을 가지고 있기 때문에 천연색소에 대한 선호도와 수요가 늘어나고 있다[8]. 카로티노이드는 색을 띤 화합물로 빛을 흡수하는 성질이 있어 식물의 광합성 작용에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 최근에는 카로티노이드가 항산화 및 항염증 기능을 가짐이 밝혀지고 있다. 카로티노이드 생산은 합성이나 천연물로부터 추출하는 방법이개발되고 있으며, 최근에는 미세조류로부터 유용 카로티노이드를 생산하는 연구들이 보고되고 있다[9, 10]. 미세조류는단백질, 비타민, 미네랄, DHA 등과 같은 영양소 및 활성 물질을 함유하고 있으며, 특히 크산토필과 베타카로틴을 다량함유하고 있으므로 카로티노이드 생산을 위한 중요한 천연자원으로서 그 가치가 높다[11−13]. 클로로필은 식물체에 널리 분포하는 녹색의 색소로 카로티노이드와 함께 단백질 또는 지단백질과 결합한 상태로 엽록체에 존재하며 식물의 광합성에 중요한 역할을 한다[14]. 클로로필은 상처 치료 효과, 세균 생육 저지 효과, 조혈 작용, 간 기능 증진 작용 등생리 활성으로 건강보조 식품에 널리 이용되고 있고, 항산화성뿐만 아니라 항돌연변이 및 항암성이 보고되고 있다[9−11].

본 연구에서는 미세조류 Haematococcus sp.를 대상으로mixotroph 배양 조건에서 기본 배지를 선정하고, L/D cycle,탄소원과 질소원의 종류 및 농도의 최적화를 통하여 미세조류의 대량배양에 적합한 배지 조성을 조사하였다. 또한, 미세조류의 성장과 더불어 대사산물(클로로필, 카로티노이드)의 생성을 조사하였다.

재료 및 방법

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실험 재료

본 실험에서 사용한 Haematococcus sp. (KMMCC 1464)는 한국해양미세조류은행에서 분양받아 사용하였다. 실험에사용한 시약들은 시약급을 사용하였다.

미세조류 배지 최적화

배지 선정. 배지 종류에 따른 Haematococcus sp.의 성장을비교하기 위하여 modified MS, BG11, JM, F/2 배지를 대상[16−18]으로 배지의 pH를 7로 조절하여 121°C에서 15분간멸균하여 사용하였다. 빛과 탄소원을 모두 제공한mixotrophic의 형태로 배양을 진행하였으며, 탄소원으로glucose 10 g/l를 사용하였다. 배양은 250 ml 플라스크에 배지량을 100 ml를 기준으로 하여 shaking incubator (Vision Scientific Co., Ltd, Korea)에서 120 rpm, 23°C, L/D cycle을 16:8로 설정하여 14일 동안 배양하였다. 또한, 접종에 사용한 미세조류는 배양 전 4일 동안 전배양 후 접종에 사용하였으며, 초기 미세조류의 농도(OD) 값은 0.2−0.3 사이가되도록 하였다.

L/D cycle의 영향. L/D cycle에 따른 미세조류의 성장을 비교하기 위해 L/D cycle을 16:8, 12:12, 8:16의 3가지 형태로배양을 진행하였다. 형광등을 사용하여 100 µmol/m2/s의 광도로 조사하였다.

탄소원의 영향. 탄소원에 따른 미세조류의 성장과 대사산물의 비교를 위하여 glucose, galactose, sucrose, xylose, fructose, cellobiose를 대상으로 10 g/l씩 첨가하여 배양하였다. 최적 탄소원의 농도는 5−30 g/l의 농도로 배양하였다.

질소원의 영향. 질소원에 따른 미세조류의 성장과 대사산물의 생산을 비교하기 위하여 NaNO3, KNO3, NH4NO3, NH4Cl, (NH4)2SO4를 1.5 g/l씩 배지에 첨가한 후 최적 질소원을 선정하였다. 최적 질소원의 농도는 선정된 질소원의 농도를 0.75−6.00 g/l의 농도로 첨가하여 배양하였다.

건조세포중량 측정. 배양한 미세조류는 원심분리기를 사용하여 분리한 후 동결건조기(-80°C, SFDSM 24L, Samwon Freeze Engineering Co., Korea)를 이용하여 3일 동안 동결건조하여 미세조류 건조중량을 측정하였다. 미세조류의 성장은 분광광도계(Ultrospec® 3000)를 사용하여 660 nm에서흡광도를 측정하였으며, 건조세포중량과 흡광도 값과의 관계식을 이용하여 환산하여 사용하였다.

클로로필, 카로티노이드 추출 및 측정. 배양한 미세조류는 원심분리를 사용하여 분리한 후 동결건조한 시료를 대상으로대사산물의 추출에 사용하였다. 동결 건조한 미세조류 분말10 mg에 메탄올 10 ml를 첨가하여 60°C에서 30분 동안 추출 후, 0°C에서 5분간 냉각시킨 뒤 상등액을 분리하였다. 그뒤 650 nm, 665 nm, 461 nm, 664 nm의 파장에서 흡광도를 측정하여 다음과 같은 식에 대입하여 클로로필과 카로티노이드양을 구하였다[19].

Chlorophyll (mg/l) = 25.5×A650+4×A665
Carotenoids (mg/l) =A461−0.046×A664×4

이때 A는 absorbance로 흡광도를 나타내며, 650, 665, 461, 664는 각각의 파장을 의미한다.

통계분석

모든 실험은 2회 이상 반복하여 각 항목에 따라 평균값± 표준편차를 구하여 결과를 평가하였다. 결과의 통계적 유의성은 SPSS 소프트웨어(버전 23.0; SPSS Inc., USA)를 사용하여 분산 분석(ANOVA)과 Duncan의 다중 범위 테스트(p < 0.05)를 통하여 평가하였었다.

결과 및 고찰

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기본배지 선정

기본배지의 선정을 위해 modified MS, BG11, JM, F/2의4종의 배지에 glucose 10 g/l를 각각 첨가하여 Haematococcus sp.를 14일 동안 배양한 결과를 Fig. 1에 나타내었다. Haematococcus sp.의 경우 modified MS 배지에서5.5 ± 0.39 g/l (growth rate 2.24 ± 0.12 day-1)로 가장 높은세포성장을 나타내었다. BG11에서 2.8 ± 0.26 g/l, JM과F/2에서 각각 1.2 ± 0.02 g/l, 0.2 ± 0.05 g/l의 세포성장을 나타내었다. 특히 F/2 배지에서 Haematococcus sp.는 거의 성장하지 않았다. 위 결과로부터 Haematococcus sp.의 경우 기본 배지를 modified MS 배지로 설정하고 L/D cycle 실험을진행하였다.

Figure 1.Effect of culture medium on the cell growth of Haematococcus sp.

L/D cycle의 영향

Modified MS 배지에 10 g/l의 glucose를 첨가한 후, L/D cycle을 16:8, 12:12, 8:16으로 설정한 후 14일 동안 배양한결과를 Fig. 2에 나타내었다. 16:8 L/D cycle에서 4.98 ± 0.16 g/l로 가장 높은 세포성장을 나타내었다. 또한 생성된클로로필과 카로티노이드(Fig. 2B)는 12:12 L/D cycle 조건에서 각각 37.70 ± 2.26 mg/l, 9.91 ± 0.37 mg/l로 가장 높은추출량을 나타내었다. 클로로필과 카로티노이드 추출량에 건조세포중량을 곱한 생산량을 Fig. 2C에 나타내었다. 생산량으로 볼 때 세포성장이 높았던 16:8 L/D cycle에서 가장 높은 값을 보였다. 이때 각각 162.14 ± 13.99 mg/l, 44.35 ± 1.27 mg/l가 생산되었다. 실험에는 가장 세포성장이 높았던16:8 L/D cycle을 최적 조건으로 확립하고 모든 조건에서 L/D cycle을 16:8로 고정하고 실험을 진행하였다.

Figure 2.Effect of L/D cycle on the cell growth and metabolite formation of Haematococcus sp. (A) cell growth, (B) metabolite extraction amount, (C) Production amount

탄소원 종류의 영향

배양에 알맞은 탄소원 종류를 알아보기 위해 glucose, galactose, fructose, xylose, cellobiose, sucrose를 대상으로10 g/l씩 첨가하여 14일 동안 배양한 결과를 Fig. 3에 나타내었다. 그 결과 glucose, galactose, cellobiose, sucrose를첨가한 배지에서 각각 5.58 ± 0.25 g/l, 5.82 ± 0.13 g/l, 5.82 ± 0.30 g/l, 5.99 ± 0.21 g/l로 통계적으로 유의한 비슷한세포성장을 보였으며, fructose와 xylose에서는 각각 4.6 ± 0.25 g/l, 4.9 ± 0.27 g/l의 세포성장으로 나머지 탄소원에 비해 비교적 낮은 값을 나타내었다. 최적 탄소원으로 세포성장과 경제적인 면을 고려하여 glucose를 선택하였다.

Figure 3.Effect of carbonsource on the cell growth and metabolite formation of Haematococcus sp. (A) cell growth, (B) metabolite extraction amount, (C) Production amount.

클로로필과 카로티노이드를 추출한 결과(Figs. 3B와 C), xylose를 첨가한 경우에서 41 ± 3.42 mg/l의 클로로필, 9.6 ± 0.44 mg/l의 카로티노이드가 확인되어 가장 많은 양이 추출되었다. 세포성장은 높았던 cellobiose나 galactose의 경우에는 클로로필이 각각 6.5 ± 0.93 mg/l, 8.8 ± 0.78 mg/l 추출되었고, 카로티노이드는 2 ± 0.17 mg/l, 2.5 ± 0.21 mg/l로상대적으로 낮은 추출량을 나타내었다. 이 두 가지 탄소원을사용할 경우 세포성장은 높게 나타나지만, 대사산물을 많이생성하지 못하는 것으로 판단된다. Fig. 3C의 경우에는 추출된 클로로필과 카로티노이드 값에 건조세포중량을 곱한 총생산량을 나타내었다. 총생산량의 관점에서도 역시 xylose에서 203.2 ± 15.34 mg/l의 클로로필, 47.8 ± 3.80 mg/l의 카로티노이드로 가장 높은 값을 나타냈으며, sucrose 또한188 ± 0.87 mg/l, 46.3 ± 0.60 mg/l로 비슷한 값을 나타냄을알 수 있었다. 위 결과로 보아 클로로필과 카로티노이드 생산에는 xylose나 sucrose가 적절한 탄소원이라고 판단된다.

탄소원 농도의 영향

탄소원으로 glucose를 5−30 g/l가 되도록 첨가하여 14일 동안 배양한 결과를 Fig. 4에 나타내었다. 그 결과 30 g/l의glucose를 첨가하였을 경우 9.3 ± 0.11 g/l로 가장 높은 성장을 나타냈으며, 10 g/l와 20 g/l에서 각각 7.35 ± 0.31 g/l, 7.83 ± 0.09 g/l로 그 뒤를 이었다. 30 g/l일 경우 세포성장은높았지만, growth rate로 비교한 결과, 10 g/l (2.95 ± 0.05 day-1), 20 g/l (3.0 ± 0.06 day-1)와 비슷한 3.17 ± 0.25 day-1로 나타났다. 기질 농도당 세포성장이 가장 높은 10 g/l를 최적 농도로 결정하였다.

Figure 4.Effect of glucose concentration on the cell growth and metabolite formation of Haematococcus sp. (A) cell growth, (B) metabolite extraction amount, (C) Production amount.

클로로필과 카로티노이드 추출을 한 결과(Fig. 4B), 전체적으로 glucose 농도가 증가할수록 클로로필과 카로티노이드 함량이 감소함을 확인하였다. 5 g/l에서 23.53 ± 8.51 mg/l의 클로로필과 4.55 ± 1.63 mg/l의 카로티노이드가 추출되었다. 클로로필과 카로티노이드의 생산량을 비교한 결과(Fig. 4C), 10 g/l의 glucose에서 가장 높은 생산량을 나타내었다.생산된 클로로필은 94.54 ± 2.46 mg/l로 나타났고, 카로티노이드는 21.04 ± 0.06 mg/l가 생산되어 가장 많은 양이 생산됨을 볼 수 있었다. 클로로필과 카로티노이드 생산에 적절한탄소원 농도는 10 g/l로 충분할 것으로 판단되었다. 세포성장과 대사산물의 생산량을 고려하여 10 g/l의 glucose를 최적 농도로 결정하였다.

질소원 종류의 영향

질소원으로 NaNO3, KNO3, NH4NO3, NH4Cl, (NH4)2SO4를1.9 g/l의 농도로 첨가하여 14일 동안 배양한 결과를 Fig. 5에 나타내었다. NO3가 첨가된 질소원(NaNO3, KNO3)의 경우 높은 세포성장을 보였지만, NH4가 첨가된 배지에서는Haematococcus sp.의 성장이 낮았다. KNO3의 경우에5.12 ± 0.05 g/l로 가장 높은 세포성장을 보였고, 그 뒤로NaNO3가 4.53 ± 0.07 g/l로 뒤를 이었다. Growth rate의 경우 NaNO3에서 2.56 ± 0.06 day-1, KNO3에서 1.70 ± 0.01 day-1를 나타내었다. NaNO3에서 growth rate가 더 높았지만, product 생산에 큰 영향을 주지 않을 것으로 생각되어KNO3를 최적 질소원으로 결정하였다.

Figure 5.Effect of nitrogen source on the cell growth and metabolite formation of Haematococcus sp. (A) cell growth, (B) metabolite extraction amount, (C) Production amount.

클로로필과 카로티노이드 추출량을 비교한 결과(Fig. 5B), NaNO3를 질소원으로 사용한 경우에서 클로로필 47.70 ± 1.58 mg/l, 카로티노이드 9.21 ± 0.25 mg/l가 추출되어 가장많은 양이 추출되었다. KNO3의 경우에서는 32.73 ± 3.91 mg/l의 클로로필이 추출되었으며, 6.75 ± 0.7 mg/l의 카로티노이드가 추출되었다. 또한, NH4가 함유된 배지에서는 성장도 많이 일어나지 않았으며, 클로로필과 카로티노이드 생산량 또한 매우 적었음을 확인하였다. 클로로필과 카로티노이드 추출량은 생산량(Fig. 5B)과 비교해보았을 때, 그 분포가비슷하였다. NaNO3를 질소원으로 배지에 첨가하였을 경우생성되는 클로로필은 215.78 ± 4.69 mg/l이었으며, 카로티노이드는 41.68 mg/l로 가장 높은 생산량을 나타내었다. 대사산물의 생성을 위해서는 KNO3보다 NaNO3를 사용하여 배양하는 것이 적절하다고 판단된다.

질소원 농도의 영향

질소원으로 선정한 KNO3를 0.95−7.6 g/l의 농도가 되도록첨가하여 Haematococcus sp.를 14일 동안 배양한 결과를Fig. 6에 나타내었다. 실험 결과, 1.9 g/l의 농도에서 가장 높은 세포성장(4.65 ± 0.48 g/l)를 보였다. 3.8 g/l 이상의 질소원 농도에서는 거의 일정한 세포성장을 보여, 성장에 오히려방해가 되는 것으로 판단된다. Growth rate 또한 1.9 g/l의질소원 농도에서 1.89 ± 0.23 day-1로 가장 높았으며, 농도가3.8 g/l를 넘어가면 1.3 ± 0.2 day-1로 일정한 growth rate를보였다. 따라서 Haematococcus sp. 배양의 최적 질소원 농도는 1.9 g/l로 결정하였다.

Figure 6.Effect of nitrogen concentration on the cellgrowth and metabolite formation of Haematococcus sp. (A) cell growth, (B) metabolite extraction amount, (C) Production amount.

배양이 끝난 미세조류로부터 클로로필과 카로티노이드를추출한 결과(Fig. 6B), 1.9 g/l, 3.8 g/l, 그리고 7.6 g/l의 조건에서 거의 비슷한 결과를 나타내었다. 질소원 농도가 0.95 g/l인 경우에는 세포성장도 낮았지만 추출되는 클로로필과 카로티노이드의 양 또한 매우 낮게 나타났다. 클로로필과 카로티노이드 추출량에 건조세포중량을 곱한 총 생산량 결과(Fig. 6C), 총 생산량은 1.9 g/l에서 가장 높았으며, 그 값은 각각153.85 ± 6.56 mg/l, 36.18 ± 1.14 mg/l로 나타났다. 그 뒤로KNO3의 농도가 높아질수록 점점 생산량이 낮아지는 경향을나타내었다.

최적 조건에서 미세조류 배양

최적화한 배지 조성으로 Haematococcus sp.를 14일 동안 배양하여 얻은 결과를 Fig. 7에 나타내었다. 배양시간이 경과함에 따라 건조세포 중량이 증가하는 경향을 나타내었으며, 이후 6일 부터는 일정하게 유지되었다. Growth rate의경우 4일에서 가장 높았으며 시간이 지남에 따라 그 값이 감소하면서 일정하게 나타났다. 또한 클로로필과 카로티노이드의 경우 8일까지 증가하다가 (174.1 ± 6.9 mg/l, 42.80 ± 1.7 mg/l), 이후부터 14일까지 거의 일정한 생성량을 나타내었다. Growth rate가 떨어짐에 따라 클로로필과 카로티노이드 값이 증가한 것으로 보아 생장을 다 끝낸 후 클로로필과카로티노이드가 많이 생성되는 것으로 판단된다.

Figure 7.Time course of cell growth and metabolite formation of Haematococcus sp. under optimum condition.

요약

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Haematococcus sp.를 대상으로 mixotroph 형태에서 배양을 위한 배지 최적화 연구를 수행하였다. 기본 배지로는modified MS 배지가 적절했으며, 탄소원으로는 glucose가,그리고 농도는 10 g/l가 적합하였다. 질소원으로는 KNO3를선정하였으며, 농도는 1.9 g/l이 최적이었다. 최적의 배지조건에서 Haematococcus sp.를 초기 접종량(0.18 g/l)로 접종하여 14일 후에 5.58 ± 0.25 g/l로 성장하였으며, 이는 건조세포중량 기준으로 약 31배의 성장한 것이다. 이때 생성된클로로필은 172.16 ± 7.79 mg/l였으며, 카로티노이드는42.33 ± 1.91 mg/l이었다. 본 연구의 결과는 추후 미세조류대량 배양과 대사산물의 생산에 이용가능한 기초자료가 될수 있을 것이라 판단된다.

Conflict of Interest

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The authors have no financial conflicts of interest to declare.

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