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Microbiology and Biotechnology Letters

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Environmental Microbiology (EM)  |  Biodegradation and Bioremediation

Microbiol. Biotechnol. Lett. 2024; 52(4): 383-396

https://doi.org/10.48022/mbl.2410.10002

Received: October 14, 2024; Revised: October 31, 2024; Accepted: November 12, 2024

중금속 오염 토양에서 기장의 발아 및 초기 생장 향상을 위한 Arthrobacter sp. YM27 활용

Application of Arthrobacter sp. YM27 for Promoting Germination and Early Growth of Panicum in Heavy Metal-Contaminated Soil

Subin Hwang, Sojung Joo, Yumin Lee, Soo Yeon Lee, and Kyung-Suk Cho*

Department of Environmental Science and Engineering, Ewha Womans University, Seoul 03760, Republic of Korea

Correspondence to :
Kyung Suk Cho,        kscho@ewha.ac.kr

Abstract

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Contaminated soil with heavy metals like cadmium (Cd) severely inhibits plant growth. In this study, we isolated 34 strains of metal-resistant bacteria with plant growth-promoting characteristics from soil around a smelter. Among them, Arthrobacter sp. YM27 was selected for its excellent activities, including indole-3-acetic acid production, exopolysaccharide production, and catalase activity. The YM27 strain exhibited over 72% antifungal activity against the pathogenic fungus Botrytis cinerea and could grow at Cd concentrations up to 50 μM, with a half-maximal effective concentration (EC50) of 4.38 ± 0.50 μM. When inoculated into Cd-contaminated soil (216.40 ± 4.10 ppm), the effects of YM27 on panicum (Panicum miliaceum L.) germination and growth were examined. Under YM27 inoculation, the germination rate increased by 1.3 times, and chlorophyll content increased by 1.09 times compared to the control. The lengths of the panicum shoot and root were 1.5 and 1.6 times greater, respectively (p < 0.05), with fresh weights increasing 1.67 times and 2 times (p < 0.05). The germination index of panicum under Cd contamination reached 440%, and the vigor index improved 2.2 times compared to the control. This study confirms that the inoculation of Cd-resistant Arthrobacter sp. YM27 can enhance panicum germination and biomass in metal-contaminated soils, suggesting its potential as a valuable resource for improving phytoremediation efficiency.

Keywords: Arthrobacter, panicum, plant growth promotion, anti-fungal activity, germination

Graphical Abstract


서론

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광산 주변 지역 및 산업단지 주변 토양은 카드뮴(Cd)으로오염되어 있는 지역이 많다[1]. Cd는 Cd로 오염된 토양 내서식하는 식물의 전신 저항성을 약화시켜 병원균 및 스트레스 요인(가뭄 등)에 대한 식물 내성을 저하시키고 식물의 생리적 유지를 방해한다[2, 3]. Cd는 식물 뿐만 아니라 동물과인간에게도 독성이 있어 특별히 우려되는 중금속이며 더욱이 식물 축적을 거쳐 먹이 사슬을 통해 동물과 인간에 축적될 수 있다[3]. 따라서 Cd로 오염된 토양을 정화하는 것은 인간 건강을 비롯한 토양 생태계의 기능 회복을 위해 매우 중요하다[1].

Cd로 오염된 토양을 정화하기 위해 이온 교환, 용매 추출, 화학적 산화/환원, 화학적 침전, 여과, 역삼투, 전기 화학적 처리 및 증발회수와 같은 물리화학적 기술이 널리 사용되고 있으나, 이러한 방법들은 무작위 금속 이온 제거 및 독성 슬러지 형성과 같은 2차 환경 오염 문제를 유발한다[1]. 중금속으로 오염된 토양을 정화하기 위해 최근에는 물리 화학적 기술의 한계점을 극복할 수 있는 다양한 생물학적 접근 방식이 적용돼 왔다[1]. 그중 식물과 식물 성장 촉진 세균(Plant growth promoting bacteria, PGPB)의 상호작용을 이용한식물 복원 기술(Phytoremediation)을 이용하면 오염 토양에서 중금속을 제거 및 안정화할 수 있다[1]. 이 기술은 환경친화적이고 2차 오염이 적으며, 정화 지역의 조경을 개선하거나 정화지역을 농경지로 활용할 수 있는 등 여러 장점이있다[4]. 해당 기술에서는 PGPB의 역할이 가장 중요한데, 일부 PGPB는 중금속 내성을 가지며 식물 성장을 촉진할 수 있다[5−7]. PGPB는 indole-3-acetic acid (IAA) 생성, siderophore활성, 1-aminocyclopropane-1-carboxylate (ACC) deaminase활성, 인산 가용화, exopolysaccharide (EPS) 생성 및 항산화효소 활성 등 다양한 기작을 통해 식물 성장을 촉진한다[5, 8, 9]. 또한, 이들은 중금속으로 오염된 환경에서 토양 환경(pH 및 생리활성 물질 등)을 개선하여 식물 성장을 촉진하고 킬레이트제를 방출하여 금속 이동성을 변경해 식물 금속내성을 향상했다고 보고되고 있다[10]. 토양 내 존재하는 식물 병원균 과의 길항 작용과 식물에서 병원균에 대한 전신저항성을 유도하여 병원성 미생물로부터 발현되는 질병을억제시킬 수 있다[2]. 이러한 다양한 기작을 통해 숙주 식물의성장이 잘 유지되도록 조절하고 생물살충제의 역할을 하기도한다[2]. 대표적인 PGPB로는 Pseudomonas, Arthrobacter, Agrobacterium, Bacillus, Azoarcus, Azospirillum, Azotobacter, Burkholderia, Klebsiella, Alcaligenes, Serratia, Rhizobium및 Enterobacter 등이 잘 알려져 있다[8, 10]. 따라서 토양 내중금속 오염을 정화하기 위해 식물과 PGPB를 동시에 적용하는 것은 매우 유망한 접근 방식이다[5].

기장(Panicum miliaceum L.)은 혹독한 환경에 대한 저항성을 지니고 있고, 다른 작물에 비해 빽빽한 잔뿌리가 형성되어 영양소와 물 사용량이 많아 스트레스 저항성을 위한 선구적인 작물로 알려져 있다[11, 12]. 기장은 일반적으로 독성 금속에 내성이 있으며 근권에서 금속을 안정화해 오염된위치에서 독성 금속의 양을 감소시킬 수 있다[13]. 선행 연구에서 Panicum 속의 P. virgatum L., P. repens L., P. maximum Jacq. 및 P. antidotale Retz. 등은 중금속 오염토양 정화를 위해 연구되었다[12].

중금속 내성과 식물 성장 촉진 능력을 지닌 PGPB에 대한연구는 오랜 기간 동안 상당한 연구가 이루어지고 있으나 식물 복원 기술을 이용해 중금속 오염 토양의 정화 효율 향상을 위해서는 식물 성장 촉진과 동시에 항진균 능력이 있고중금속을 정화할 수 있는 다기능성 PGPB 자원 개발이 중요하다[3]. 본 연구에서는 제련소 주변 토양으로부터 Cd에 내성을 지닌 세균을 순수분리한 후 동정하였다. 분리한 Cd 내성 세균을 대상으로 식물 성장 촉진 활성과 식물 병원성 진균에 대한 항진균 활성을 평가하여 우수한 균주를 선별하였다. 선별 균주의 중금속으로 오염된 토양에서 기장의 발아및 성장에 대한 접종 효과를 평가하였다.

재료 및 방법

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Cd 내성 세균 분리

Cd 함유 배지를 제조하기 위해 CdCl2·H2O 시약을 이용하여 Cd의 농도가 1 M이 되도록 stock을 만들었다. 멸균한 여과필터(0.45 μm)와 실린지를 이용해 Cd stock 용액은 제균처리하였다. 1/10 희석 Luria-Bertani (LB) 배지(Difco, USA)는 1 g/l tryptone, 0.5 g/l yeast extract 및 1 g/l NaCl에15 g/l 한천을 첨가한 후 120℃에서 15분간 멸균하였다. 멸균한 1/10 LB 배지에 최종 Cd 농도가 각각 0.01, 0.1, 0.5 및1mM이 되도록 Cd stock 용액을 첨가한 후, 페트리디쉬에분주하였다.

경상북도에 위치한 OO 제련소(37°04'N, 129°06'E) 근처 표토로부터 약 20 cm 이하 깊이에서 토양을 채취하여 2 mm체로 거른 후 실험에 사용하기 전까지 4℃에서 보관하였다.토양 시료는 환경기술정책연구원(NeLab)에 분석 의뢰하여토양 pH, 산화-환원 전위(Oxidation-reduction potential),전기전도도(Electric conductivity), 유기물 함량(Organic carbon content), 유효 인산(Orthophosphate), 총질소(Total nitrogen), 중금속 함량(As, Cd, Cu, Pb 및 Zn) 및 총 세균수를 측정하였다.

시험관에 채취한 토양 1 g과 멸균수 9 ml를 넣어 900 ×g에서 1분 동안 교반하고, 15분간 정치한 후 상등액을 채취하였다. 상등액을 10-4까지 10배씩 연속 희석하여 준비하였다.희석액을 Cd (0.01, 0.1, 0.5 및 1 mM)이 첨가된 1/10 LB-agar 배지에 200 µl씩 분주하여 도말하였다. 희석액을 접종한 배지를 30℃에서 72시간 동안 배양하였으며, 배양 후 생장한 콜로니의 색과 모양에 따라 총 34개의 콜로니를 선별하였다.

Cd 내성 세균의 식물 성장 촉진 활성 평가

5 ml의 1/10 LB 배지에 1차 선별한 Cd 내성 균주를 접종하고 30℃에서 72시간 동안 진탕 배양(140 rpm)하여 배양액을 원심분리하였다. 상등액을 제거하고 멸균수로 세척 후회수한 균체에 멸균수를 첨가하여 600 nm에서 흡광도가 0.6이 되도록 균체 현탁액을 만들었다. 이 균체 현탁액을 PGP활성 정성평가를 위한 접종액으로 사용하였다.

IAA 생성능력 평가. 다음 과정을 통해 Cd 내성 균주의 식물성 호르몬인 IAA 생성능을 평가하였다[14]. 0.1% L-tryptophan (100 ml LB broth에 0.1 g L-tryptophan을 혼합한 용액)이 첨가된 배지에 균체 현탁액 10%(v/v)를 첨가한후 35℃에서 24시간 배양하였다. 이 배양액을 원심분리(13,200 ×g, 1 min)하여 얻은 상등액 400 µl와 Salkowski’s reagent (HClO4 (35%, v/v) 98 ml와 0.2 M FeCl3·6H2O 2ml을 혼합한 용액) 800 µl을 혼합한 후 암조건에서 30분동안 정치시켰다. 균체를 침전시키고 상층액만 수득하기 위해, 13,200 ×g에서 1분 동안 원심분리 하였다. 상등액이 분홍색~자주색으로 발색되는 정도를 535 nm에서 흡광도 측정하였다.

Siderophore 생성능력 평가. Cd 내성 균주의 금속 성분과의 결합 물질인 siderophore 생성 여부를 측정하였다[15−17]. Chrome azurol S (CAS) 60.5 mg를 50 ml 멸균수에 녹인용액, 1 mM의 FeCl3 6H2O를 10 mM HCl에 첨가하여 만든3가지 용액 10 ml 및 hexa-decyl-trimethyl-ammonium-bromide (HDTMA) 72.9 mg을 멸균수 40 ml에 녹인 용액을혼합하여 blue dye 용액 100 ml을 제조하였다. Piperazine-N,N’-Bis-2-ethanesulfonic acid (PIPES) 30.24 g을 증류수750 ml에 용해한 후, 15 g의 agar를 첨가하고 NaOH를1.06 g 넣어서 pH를 6.8로 조정하여 PIPES 배지를 제조한후 멸균하였다. 멸균한 PIPES 배지와 blue dye 용액은 클린벤치에서 혼합한 후 페트리디쉬에 분주하였다. 페트리디쉬 정중앙에 paper disc를 치상하고 그 위에 각 균주의 현탁액을 6 µl씩 접종하였다. 30℃에서 14일간 배양한 후 콜로니 주변에 주황색 또는 다홍색의 환 형성 여부를 조사하였다.

인산 가용화능력 평가. 식물 성장에 필요한 영양분 중 제한요소로 작용하는 인산을 식물에 제공하는 데 도움이 되는 선별 균주들의 인산 가용화능력을 Pikovaskaya's 배지를 이용해서 평가하였다[20]. 이 배지의 조성은 glucose 10 g/l,(NH4)2SO4 0.5 g/l, KCl 0.2 g/l, MgSO4 0.1 g/l, MnSO4 0.002 g/l, FeSO4 0.002 g/l, yeast extract 0.5 g/l, Ca3(PO4)2 5 g/l 및 agar 20 g/l이다. Pikovaskaya’s-agar 배지를 분주한페트리디쉬 정중앙에 paper disc를 치상하고 그 위에 각 균주의 현탁액을 6 µl씩 접종하였다. 30℃에서 14일간 배양한후 균총 주변에 투명환 형성 여부를 조사하였다.

EPS 생성능력 평가. 선별 균주의 EPS 생성능력 평가를 위해 Congo red agar (CRA) 배지 상에서 검은색의 콜로니가형성되는지 육안으로 확인하였다. 0.4 g의 Congo red powder와26 g의 brain heart infusion Agar (BHIA)에 첨가하고3%(w/v)의 sucrose 용액(500 ml 증류수에 15 g sucrose을혼합한 용액)을 첨가하여 CRA 배지를 제조하였다[20]. Cd내성 균주를 CRA 배지에 접종하였을 때, 콜로니 주변의 EPS가 생성되어 Congo red와 결합해 검붉은색의 콜로니의 형성 여부로 생성능력을 판단하였다.

항산화 능력 평가. 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH)활성평가. 선별 균주의 DPPH 활성을 평가하기 위하여 다음과 같이 수행하였다[18−20]. 각 선별 균주 현탁액 1 ml와 동량의 0.2 mM DPPH solution (1:1, v/v)를 혼합하고, 30℃에서 30분간 암조건에서 배양한 후 반응액의 흡광도를 517 nm파장에서 측정하였다. 대조군으로는 선별 균주 현탁액 대신에 99.9% ethanol (EtOH)를 사용하였다. 다음 식을 이용하여 DPPH 라디칼 소거능을 정량적으로 평가하였다.

DPPH radical scavenging activity (%) =1−A−BA×100

여기서 A는 대조군, B는 실험군에서 DPPH solution을 가한후 517 nm에서 측정한 흡광도 값을 의미한다.

Catalase 활성평가. 선별 균주의 catalase 활성은 다음과같이 평가하였다[21]. 표준 곡선 작성을 위하여 catalase powder (2950 units/mg, product no. C1345, Sigma-Aldrich)를 멸균수로 희석하여 0−60 units의 표준 용액을 각각 100 µl씩 제조하였다. Catalase 표준 용액과 선별 균주의현탁액을 각각 100 µl씩을 유리 시험관에 첨가한 후, 1%Triton X-100 용액 100 µl와 30% 과산화수소 100 µl를 첨가하고 상온에서 15분 동안 반응시켰다. 표준 용액을 반응시켜 생성된 bubble의 높이를 측정하여 catalase 활성과bubble의 높이 사이의 상관관계를 이용하여 표준곡선을 작성하였다. 균주 현탁액을 반응시킨 후 시험관 내에서 일정하게 유지되는 bubble의 높이를 측정하여 앞서 작성한 표준곡선에 따라 catalase 활성을 정량화하였다.

식물 병원성 진균에 대한 항진균 능력 평가

식물 병원성 진균에 대한 선별 균주의 항진균 능력을 평가하기 위하여 식물 병원성 진균(Botrytis cinerea KACC 40573)을 국립농업유전자원센터(Korea Agriculture Culture Collection, KACC)로부터 분양받았다. 진균은 potato dextrose 배지(PD medium, MBcell, USA)에 7일간 배양하여 실험에 사용하였다. 10 ml의 PD 배지에 균주 현탁액 10%(v/v)를 접종하여 25℃에서 24시간 동안 진탕배양(140 rpm)하였다. 배양액을 5분 동안 원심분리(5,000 ×g)하여 균체를회수한 후 회수한 균체에 10 ml 멸균수를 넣어 재원심분리하여 균체를 회수하였다. 앞선 과정을 2회 반복한 후 이렇게세척한 균체에 멸균수를 OD600 nm에서 0.6이 되도록 첨가하여 균체 현탁액을 제조하였다. 선별 균주의 항진균능력 평가는 다음과 같이 수행하였다[22]. LB 배지와 PDB 배지를 1:1 (v/v)로 혼합하여 직경이 90 mm인 페트리디쉬에 10 ml씩 분주하였다. 한 개의 페트리디쉬 당 2개의 paper disc (직경6mm)를 동일한 간격으로 치상하였다. 한쪽의 disc에는 식물 병원성 진균 균체 현탁액 6 µl (OD600 nm)를 접종하였고,다른 한 쪽에는 균주 현탁액을 접종하여 대치 배양하였다.균주 현탁액 대신 멸균수를 접종한 페트리디쉬를 음성 대조군(무처리구)으로 설정하였다. 2개의 disc에 균주 현탁액을접종한 페트리디쉬를 양성 대조군으로 설정하였고, 무처리구의 식물 병원성 균사가 페트리디쉬 전체를 채울 때까지35℃에서 14일 동안 배양 후 식물 병원성 균주와 접종한 균주 현탁액 간의 거리를 측정하여 억제율(inhibition rate)로 환산하였다.

Inhibition rate (%)=R−rtrc×100

여기서 R은 식물 병원균과 분리 균주 사이의 거리(mm), rt는 실험군 및 양성 대조군에서의 생장 반경(mm), rc는 무처리구(음성 대조군)에서의 식물 병원균 생장 반경(mm)을 의미한다.

PGP 활성 및 항진균 활성 능력이 우수한 균주 선별 및 동정

Cd 내성 균주의 PGP 활성 및 항진균 활성 능력을 비교 평가하여 상대적으로 우수한 균주 6종을 2차 선별하였다. 6종의 균주는 YM15, YM18, YM23, YM27, YM29 및 YM33이었으며, 16S rRNA의 부분 염기서열을 분석하여 동정하였다[23]. 멸균한 이쑤시개를 사용하여 선별 균주의 콜로니를1.5 ml microcentrifuge tube에 넣고 멸균수 30 µl 주입하여충분히 현탁시킨 다음 8,200 ×g에서 5초간 원심분리하였다.균체를 lysis 시키기 위해 heat block을 이용하여 95℃에서15분간 열처리한 후, 8,200 ×g에서 5초간 원심분리하였다.이러한 lysis 과정을 3번씩 반복하고 추출된 genomic DNA를 주형(template)으로 하여 polymerase chain reaction (PCR)을 수행하였다. 총 박테리아의 16S rRNA 유전자를 타겟으로 하는 27F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')와1492R (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3') 프라이머를 사용하였다. DNA 주형 2 µl, 10 μM의 각 프라이머 1 µl, dNTPs (2.5 mM) 4 µl, PCR buffer (with MgCl2) 5 µl 및Taq polymerase 0.25 µl를 넣고 멸균한 증류수로 최종 부피를 50 µl로 맞추었다. PCR 조건은 94℃에서 3분 동안 pre-denaturation한 후, denaturation (94℃, 30초), annealing (55℃, 30초) 및 extension (72℃, 30초) 과정을 30 cycle 반복하였으며, 72℃에서 5분 동안 최종 extension을 진행하고4℃에서 holding 하였다. 증폭된 PCR 산물을 전기영동 분석으로 길이를 확인한 다음 동결하여 ㈜마크로젠에 분석 의뢰하였다. 염기서열이 분석된 균주는 The National Center for Biotechnology Information (NCBI) website의 Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)을 이용하여 GenBank database와 비교하여 동정하였다. 이후 GenBank에 YM15 (Accession no. PQ136094), YM18 (Accession no. PQ136095), YM23 (Accession no. PQ136097), YM27 (Accession no. PQ136096), YM29 (Accession no. PQ136099) 및 YM33 (Accession no. PQ136100)의 16S rRNA 유전자의 부분 핵산 염기서열을 등록하였다.

동정한 균주의 염기서열 이외에도 중금속 내성이 뛰어난균주, 유사한 염기서열을 가진 균주 등의 16S rRNA 염기서열을 비교하고 분석하고자 다음의 프로그램들을 사용해 계통도를 작성하였다. BioEdit 프로그램(BioEdit sequence alignment editor, version 7.0.5.3)을 사용하여 염기서열을fasta 파일로 변환하였으며 DNA baser (DNA baser, version 5.15.0.0BT)로 균주들의 염기서열을 정렬했다. ClustalX 프로그램(ClustalX2.1, version 2.0)을 활용해 phb파일 생성 후 최종적으로 MEGA-X (MEGA-X, version 10.2.2)를 이용하여 계통도를 작성하였다.

최종 선별 균주 YM27의 중금속 내성 정량 평가

6종 선별 균주 중 우수한 활성능력을 보유한 YM27 균주를 대상으로 생장 속도에 미치는 Cd 농도 영향은 1/10 희석LB 액체 배지를 이용하여 평가하였다. YM27 균주를 1/10 희석 LB 액체 배지에 접종하여 48시간 동안 30℃에서 진탕배양(120−140 rpm)하였다. 수득한 배양액을 원심분리(11,400 ×g, 10분)하여 회수한 균체를 멸균수로 세척한 후, 멸균수에현탁한 균체 현탁액(OD600 nm = 0.6)을 접종액으로 사용하였다. 50 ml 삼각 플라스크에 1/10 LB 액체 배지 20 ml을 분주하고, 1 M Cd 용액을 이용하여 각각의 농도가 0, 25, 50, 100, 250 및 500 mM이 되도록 첨가하였다. Cd 첨가 1/10 LB 액체 배지에 균주 현탁액을 접종하였다(10%, v/v). 배양을 위해 35℃에서 교반(140−150 rpm)하며 2−3시간 간격으로 배양액을 1 ml씩 채취하여 600 nm에서 흡광도를 측정하였다. 균주의 비생장속도와 배가시간을 선행연구와 동일한방법으로 계산하였다[24−26].

중금속 오염 토양 내 기장 발아에 미치는 YM27 접종효과

토양 준비. YM27 균주를 순수분리한 토양인 OO 제련소 근처 토양을 이용해 2 mm 체에 걸러 발아실험에 이용하였다. 72구 플라스틱 모종판(D 53 × W 27 × H 4 cm, 한 구당 D 4 × W 4 × H 4 cm)에 한 구당 토양을 40 g씩 넣었다. YM27 균주를 접종할 기장과 접종하지 않을 기장을 구분하여 각각 30구씩 총 60구의 모종판을 세팅하였다[3].

기장 파종 및 YM27 균주 접종. 기장(이백찰기장, ㈜다농원예가든)은 종자 구입 후 사용 전까지 실온 보관하였다. 종자는 각각 210개를 10% (v/v) 차아염소산나트륨(sodium hypochlorite, NaOCl) 용액에 1시간 동안 담가 두어 표면을세척 및 소독한 후 멸균수를 이용하여 2회 세척한 후 이용하였다. YM27 균주를 1/10 LB 배지에서 35℃에서 140−150 rpm으로 배양하여 얻은 배양액을 증류수로 세척하여 OD600 nm에서 흡광도 값이 0.6인 균체 현탁액 250 ml을 준비하였다.균체 현탁액에 기장 종자를 넣고 2시간 동안 35℃에서150 rpm으로 교반하여 균주가 종자 표면에 부착되도록 하였다. 대조군으로 멸균수 250 ml에 기장 종자를 넣고 상기와 동일하게 처리하였다. 모종판 한 구당 7립씩 종자를 파종하여 대조군과 실험군에 각각 210립의 종자를 파종한 후 관찰하였다. 40%의 습도와 25℃의 온도를 유지한 항온항습실의 암조건을 반복한 조건 발아를 유도하였고, 싹이 트는 시점에서 광조건(12 h/d)과 암조건(12 h/d)에서 10일 동안 재배 및 관찰하였다.

토양 물성인자 조사. 10일 후 모종판에서 채취한 토양 시료는 반나절 이상 풍건한 후 2 mm 체로 거른 뒤 토양 중금속전 함량 측정을 위하여 4℃에서 보관하였다. 체로 거른 토양의 pH는 pH meter (Orion star A211, Thermo Fisher Scientific, USA)로 측정하였고, 건조 및 강열 전후 무게를 이용하여 수분함량과 유기물 함량을 측정하였다[27].

식물 성장인자 조사. 10일 간의 발아 및 성장기간 동안, 기장의 성장 상태를 관찰하며 발아한 종자 수를 측정하였다.발아의 기준은 싹이 튼 눈의 길이가 1 mm 이상인 것으로 하였으며, 발아한 종자 수를 매일 계수하였으며 발아능력 평가를 위해 하기의 식을 이용해 발아율(Germination percentage, G), 발아지수(Germination index, GI), 상대 종자 발아율(Relative seed germination, RSG), 상대 성장(Relative growth, RG) 및 활력지수(Vigor index)를 정량적으로 나타내었다.

Germination percentage (G) (%)=g/N×100

여기서 g는 발아 종료 후 성장한 기장의 수, N은 전체 기장의 수를 의미한다.

Germination index (GI) (%) =RSG×RG100

Relative seed germination (RSG) (%) =A/B×100

Relative growth (RG) (%) =C/D×100

여기서, A는 YM27을 접종한 조건, B는 무처리 조건에서 발아가 종료된 후 성장한 기장의 수를 의미하며 C는 YM27을접종한 조건, D는 무처리 조건에서 기장의 뿌리 길이 평균값을 의미한다.

Vigor index (VI) = G×W

여기서 G는 Germination percentage, W는 기장 줄기 생중량의 평균값을 의미한다.

10일간의 발아 실험 종료 후, 기장의 길이, 무게 및 엽록소를 측정하였다. 기장의 길이 성장은 싹을 틔운 기장을 모든 채취하여 흐르는 물로 뿌리가 뜯겨 나가지 않도록 조심히 씻어낸 후 물기를 잘 닦고 뿌리 붙은 토양을 제거하고, 줄기와 뿌리로 나누어 길이를 측정하였다. 추가로, 식물의 바이오매스를 조사하기 위해 생중량은 줄기와 뿌리를 각각 나누어 전자저울(WBA-220, DAIHAN Scientific Co, Ltd., Republic of Korea)로 0.0001 g 단위까지 측정하였다. 측정한 시료를 70℃ 항온 건조기(VS-4150ND, Vision Scientific Co, Ltd., Republic of Korea)에서 72시간 동안 건조한 다음상온에서 30분 동안 식힌 후, 앞서 측정한 생중량의 측정과마찬가지로 전자저울을 통해 건중량을 측정하였다. 기장 잎의 엽록소 함량은 SPAD (SPAD 502 plus, Konica Minolta, Japan)를 이용하여 측정하였다.

통계분석

모든 실험 결과는 3반복의 평균을 이용하여 나타내었고,평균값은 R 통계 프로그램(ver. 4.2.2)을 이용하여 정규성 검정을 거치고 일원배치 분산분석(one-way ANOVA)을 실시한 후, 신뢰구간 p <0.05 수준에서 Bonferroni 사후검정을수행하여 유의성을 평가하였다.

결과 및 고찰

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제련소 토양에서 분리한 Cd 내성 순수세균의 PGP 활성능

Cd 내성 세균을 분리하기 위해 사용한 제련소 토양의 주요 특성은 Table 1에 정리되어 있다. 제련소 토양의 pH는8.17 ± 0.05, 산화 환원 전위는 333.07 ± 27.06 mV, 유기 탄소 함량과 총 질소는 각각 1.60 ± 0.29% 및 0.02 ± 0.00%이었다. As, Cd, Cu, Pb 및 Zn의 농도는 각각 89.23 ± 0.97, 216.40 ± 4.10, 627.57 ± 16.87, 1,522.00 ± 37.69 및 5,733.20 ± 35.58 mg/kg이었다. 토양 세균 수는 1.56 ± 0.44 × 106 CFU/g-soil이었다.

Table 1 . Soil properties obtained from smelter area.

Soil propertiesValue
pH-8.17 ± 0.05
Oxidation-reduction potentialmV333.07 ± 27.06
Electrical conductivityds/m1.39 ± 0.30
Organic carbon content%1.60 ± 0.29
Orthophosphatemg/kg16.41 ± 1.10
Total nitrogen (TN)%0.02 ± 0.00
Heavy metalArsenic (As)mg/kg89.23 ± 0.97
Cadmium (Cd)mg/kg216.40 ± 4.10
Copper (Cu)mg/kg627.57 ± 16.87
Lead (Pb)mg/kg1522.00 ± 37.69
Zinc (Zn)mg/kg5733.20 ± 35.58
Soil bacteriaCFUa/g-soil1.56 × 106 ± 0.44 × 106

a CFU: Colony Forming Unit

제련소 토양을 접종원으로 Cd 함유 배지에서 생장한 콜로니의 특성에 따라 선별한 34개 세균(YM1~YM34)의 중금속내성능을 평가한 결과를 Table 2에 나타내었다. 34종의 세균 중 11종의 순수세균(YM4, YM5, YM7, YM9, YM14, YM15, YM17, YM19, YM26, YM27 및 YM28)이 Cd 0.1 mM에 대해 내성을 지니고 있었다. Cd 0.5 mM 수준에서는YM29 및 YM 31의 2종만이 생장할 수 있었고, 3종(YM32, YM33 및 YM34)만이 1 mM의 Cd 농도에서도 생장할 수 있었다. Cd 오염은 식물종의 뿌리에 의해 쉽게 흡수되고 다른중금속 종류에 비해 2−20배 더 높은 독성을 보인다[28]. 우리 연구와 유사하게 토양 내 중금속 수준을 낮추는 능력을 가진 Cd 내성 균주에 관한 결과가 보고되었는데, Pseudomonas sp. 및 Bacillus sp.는 0.5−1.0 mM Cd에서 내성능력을 보였다[28]. 또 다른 연구에서 0.1 mM Cd 수준에서 Bacillus koreensis 181−22가 생장할 수 있었으며 이는 우리 연구의YM32, YM33 및 YM34 균주에 비해 1/10 수준에 불과했다[29].

Table 2 . Characteristics of a colony, heavy metal tolerance, plant growth-promoting activity, and antioxidant activity of 34 isolates.

StrainsCharacteristics of a colony (color, shape)Heavy metal tolerance (mM)Plant Growth-Promoting activityAntioxidant Activitye
IAAa (OD535nm)Siderophore productionPhosphate solubilizationEPSd productionDPPH radical scavenging activity (%)CAT activity
YM 1ivory, circular0.010.27 ± 0.001-b-c-0.00 ± 0.402++f
YM 2ivory, circular0.010.30 ± 0.000---0.00 ± 0.201-
YM 3yellow, circular0.010.27 ± 0.001++-0.00 ± 0.161-
YM 4white, circular0.10.26 ± 0.001-+-0.00 ± 0.502++
YM 5bright ivory, circular0.10.27 ± 0.001---0.00 ± 1.393-
YM 6bright ivory, circular0.010.27 ± 0.001---39.42 ± 0.139-
YM 7light yellow, circular0.10.28 ± 0.000---0.00 ± 0.322-
YM 8ivory, circular0.010.47 ± 0.001--+20.99 ± 0.000-
YM 9beige, circular0.10.36 ± 0.019---0.00 ± 0.161+++
YM 10ivory, circular0.010.36 ± 0.001--+0.00 ± 2.520+
YM 11apricot, circular0.010.12 ± 0.001+--16.09 ± 3.002+++
YM 12apricot-like, circular0.010.27 ± 0.001--+0.00 ± 0.426+++
YM 13light yellow, circular0.010.48 ± 0.001---0.00 ± 0.836+
YM 14light yellow, circular0.10.15 ± 0.001---0.00 ± 0.279+
YM 15white, circular0.10.38 ± 0.001-+-0.00 ± 0.322-
YM 16white, circular0.010.30 ± 0.001---0.00 ± 0.161++
YM 17white, circular0.10.29 ± 0.000-++0.00 ± 0.161-
YM 18light-green, circular0.010.35 ± 0.001++-6.03 ± 0.161+++
YM 19yellow, circular0.10.30 ± 0.001-++0.00 ± 0.279-
YM 20red, circular0.010.13 ± 0.001---23.89 ± 0.424-
YM 21light yellow, circular0.010.51 ± 0.001--+0.00 ± 0.161-
YM 22light-green, circular0.010.29 ± 0.000---0.00 ± 3.507-
YM 23light yellow, star-shaped0.010.31 ± 0.000+++N.Dg++
YM 24ivory, circular0.010.30 ± 0.001---0.00 ± 3.014-
YM 25white, circular0.010.39 ± 0.001---0.00 ± 0.161+
YM 26white, circular0.10.31 ± 0.000---N.D+
YM 27yellow, circular0.10.59 ± 0.001--+0.00 ± 0.161+
YM 28light yellow, circular0.10.47 ± 0.001---0.00 ± 0.279++
YM 29white, circular0.50.37 ± 0.000--+0.00 ± 0.161+
YM 30yellow, circular0.10.17 ± 0.001--+0.00 ± 0.836-
YM 31pink, circular0.50.33 ± 0.004---0.00 ± 2.980+++
YM 32white, circular10.08 ± 0.001---55.38 ± 0.070-
YM 33apricot, circular10.24 ± 0.003+--67.80 ± 0.701+
YM 34ivory, circular10.26 ± 0.014---0.00 ± 4.284++

a IAA: indole-3-acetic acid; ACC deaminase: 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid (ACC) deaminase

b + : positive (≥ 10 mm of orange halo zone diameter), - : negative (< 10 mm diameter)

c + : positive (≥ 10 mm of clear zone diameter), - : negative (< 10 mm diameter)

d EPS: exopolysaccharide, +: positive (dark black-rounded colony on the agar plate), -: negative (pink colony)

e DPPH radical scavenging activity: 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging activity; CAT activity: catalase activity

f +++: strong positive (≤ 100 units), ++: moderate positive (≤ 50 units), +: weakly positive (≤ 30 units), -: negative (≤ 10 units)

g N.D: not detected

1차 선별한 34종 균주에 대한 식물 성장 촉진 능력 평가결과, 모두 IAA 생성능력을 보유하고 있었으나, 특히 YM 27균주가 0.59로 가장 높은 생성능을 보였다(Table 2). PGPB의 대표적인 특징 중 하나는 식물 성장 호르몬의 생성이며,가장 많이 연구되는 물질은 IAA이다[30]. IAA는 식물 뿌리세포벽을 느슨하게 하여 뿌리 삼출물의 범위를 확장하여 근권 영역에 존재하는 세균 군집의 다양성과 활동을 향상한다[30]. Bradyrhizobium sp., Pseudomonas sp., Burkholderia sp., Rhodococcus sp., Sphingomonas sp. 및 Acinetobacter sp. 등이 대표적인 IAA 생산자로 알려져 있다[30].

1차 선별 균주의 siderophore 생성능 평가 결과, 균주의 비율이 14.7%에 불과했다(Table 2). YM3, YM11, YM18, YM23 및 YM33 균주에서 가장 높은 활성을 보였다. Siderophore는 식물의 철분 함량 부족에 대응하여 PGPB가생산하는 2차 대사산물로 철과의 결합을 통해 철 킬레이트복합체를 형성하여 식물 뿌리로의 철 공급에 중요한 역할을한다[9]. 대표적인 siderophore 생산 PGPB로는 Alcaligenes faecalis, Azospirillum lipoferum, Bacillus cereus, Brevibacillus brevis 및 Pseudomonas fluroscens 등이 존재한다[9].

인은 식물 성장과 발달에 필수적인 영양소로, 효소 활성화, 단백질 합성, 광합성 및 삼투압 조절과 같은 여러 생리적 과정에 기여한다[31]. 인은 주로 토양에 고정화되어 용해되지 못하고 식물 뿌리에서 이용할 수 없는 형태로 존재한다[31]. 여러 연구에서 Azotobacter sp., Azospirillum sp. 및 Pseudomonas sp. 등의 PGPB가 무기 인을 용해하여 식물이접근 가능한 형태로 만드는 능력이 입증되었다[31]. 본 연구에서도 인산 가용화능은 1차 선별 34종 세균 중 8종 만이 활성을 보유하고 있었다(Table 2). Siderophore 생성능을 가진YM3, YM18, YM23 및 YM33 균주의 인산 가용화능력이 상대적으로 우수하였다. 그 밖에 YM4, YM15, YM17 및YM19 균주에서도 인산 가용화능력이 관찰되었다.

다당류로 구성된 EPS는 안정성 부여, 점도 및 이온 킬레이트 작용 등을 통해 양이온 중금속과 결합하여 식물로의 독성효과를 줄이고 영양분을 공급하는 역할을 한다[32]. PGPB에서 유래한 EPS는 식물 성장을 촉진하고 비생물적 스트레스에 대한 식물의 저항성을 향상하는 데 중요한 역할을 한다[32]. 본 연구에서 인산 가용화능력을 보유한 YM17 및YM19 균주에서 EPS 생성능력 또한 관찰되었으며, 이외에도 YM8, YM10, YM12, YM21, YM27, YM29 및 YM30 균주가 EPS 생성능력을 보였다(Table 2).

스트레스 조건에서 PGPB는 식물 세포에 활성 산소종(Reactive oxygen species, ROS)의 축적을 막기 위해 항산화물질을 분비한다[33]. 그 중 DPPH 라디칼 소거능력을 보유한 PGPB는 식물의 스트레스 내성에 대한 메커니즘을 생성하는 데 기여한다[33]. 선행 연구에서 DPPH 라디칼 소거능력을 보유한 균주의 접종이 벼의 성장을 향상했음을 보고했다[33]. DPPH 라디칼 소거능력은 YM33, YM32 및 YM6 균주 순으로 각각 67.80%, 55.38% 및 39.42%의 소거능력을 보유하고 있었다(Table 2).

Catalase와 같은 항산화 효소는 ROS 소거에 중요한 역할을 하며 중금속 독성과 같은 스트레스 하에서 catalase의 증가는 식물 내 면역세포의 손상을 줄여 스트레스에 대한 내성을 높일 수 있다[34]. 본 연구에서 Catalase 활성은 YM9, YM11, YM12, YM18 및 YM31 균주에서 50 units 이상의높은 활성을 보였으며 YM4, YM16, YM23, YM28 및 YM34균주에서 30 units 이상이었다(Table 2).

식물 병원성 진균(B. cinerea)에 대한 1차 선별 균주의 항진균능 평가 결과를 Fig. 1에 도시하였다. 선별 균주 중YM27 균주가 72.03%로 가장 우수한 항진균 능력을 보유하고 있었다. 회색 곰팡이로 알려진 B. cinerea는 전 세계적으로 농업 시스템에 위협을 가하는 식물 병원성 균류로, 1400종 이상의 식물종에 악영향을 미친다[35]. 특히 식물 세포의 괴사를 유도하고 에틸렌과 같은 스트레스 물질을 발현하여 식물 성장을 저해한다[35]. B. cinerea에 대하여 생물학적 방제 역할을 수행하는 미생물 자원 개발이 수행되었는데, 대표적으로 Aureobasidium pullulans, Bacillus amyloliquefaciens, B. subtilis, Pantoea agglomerans, Pseudomonas syringae, Streptomyces griseoviridis, Trichoderma atroviride 및 T. harzianum 등이 존재하는것으로 알려져 있다[36].

Figure 1.Anti-fungal activities of inhibition zon isolates against four different strains of B. cinerea. Anti-fungal activities were measured based on the size of the zones of inhibition of the pathogen. Zones of inhibition were expressed as percentages.

PGP 활성 및 항진균 활성이 우수한 Cd 내성 순수세균 6종선별 및 동정

1차 선별 균주의 Cd 내성능, PGP 및 항진균 활성을 종합평가하여, 2차 선별한 6종 세균(YM15, YM18, YM23, YM27, YM29 및 YM33)의 우수한 능력을 가진 6종 균주의동정 결과 및 계통 발생학적 특성을 Fig. 2에 도시하였다. YM15 (Accession no. PQ136094) 및 YM29 (Accession no. PQ136099) 균주는 모두 Pseudarthrobacter 속과 99.93%의유사도를 가졌다. 선행연구에서 Pseudarthrobacter oxydans은 Cd, Pb 및 Zn에 대해 각각 최대 2 mM, 4 mM 및 5 mM농도에서 생장 가능하여 여러 중금속에 대해 내성을 가지고있었다[37]. 본 연구에서는 Cd에 대한 내성능만을 평가하였으나 향후 연구에서는 Cd를 제외한 다른 중금속에 대한 내성능을 평가할 필요가 있다. 또한, Pseudarthrobacter oxydans LMR250와 Pseudarthrobacter phenanthrenivorans LMR249 균주는 각각 127 µg/ml 및 66.66 µg/ml의 IAA 생성능력을 보유하고 있었다[37]. 본 연구에서 분리한 YM15및 YM29 균주도 IAA 생성 능력이 다른 분리 균주와 비교하여 상대적으로 우수한 편에 속하였다(Table 2).

Figure 2.Neighbor-Joining Phylogenetic tree of the strain YM15, YM18, YM23, YM27, YM29 and YM33 estimated from 16S rRNA sequence. Bootstrap values (percentages of 1,000 replications) are shown at the branch points. The scale bar represents 0.02 substitutions per site. The 16S rRNA gene sequence of similar bacteria to YM15, YM18, YM23, YM27, YM29 and YM33 was used as outgroup.

YM18 (Accession no. PQ136095) 균주는 Nocardia 속과유사도가 99.78%로, 주로 항진균 활성을 보유한 속으로 알려져 있었다[38]. 특히 Nocardia mangyaensis NH1은 식물병원성 곰팡이인 Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani, Colletotrichum coccodes 및 Alternaria sp.에 대한항진균 효과가 입증되었고, 해당 균주가 생산하는 catechol-type siderophore는 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)의 독성을 감소시켰다[38]. 본 연구의 YM18 균주 또한siderophore 생성능력이 뛰어나고, 우수한 항산화 능력과 길항능력을 보유하고 있었다(Table 2).

YM23 (Accession no. PQ136097) 및 YM27 (Accession no. PQ136096) 균주는 모두 Arthrobacter sp.와 유사도가99.86%이었다. 선행 연구에서 Arthrobacter 속 세균은 Co, Zn, Cu 및 Cd 등 다양한 중금속에 대한 내성이 있는 것으로보고되었다[39]. 그 밖에도 식물 성장 촉진 능력에 관한 여러 선행 연구가 진행되었는데, Arthrobacter pascens ZZ21은IAA를 합성하여 식물의 뿌리 길이와 생체량을 증가시키고[40], Arthrobacter pascens PGPR2는 EPS 생성능을 보유하고 있었으며[41], Arthrobacter humicola B-7은 인 가용화능을 보유하고 있었다고 보고하였다[42]. 특히 Arthrobacter humicola는 미접종 조건에 비해 인 가용화 능력이 2.76배 이상 우수하였다[42]. 또한 Arthrobacter terricola GN70은 항진균 활성에서 Fusarium proliferatum 와 같은 식물 병원균에 대한 억제 능력을 보였다[43]. 선행 연구와 유사하게, 본연구에서도 YM23과 YM27의 IAA 생성능, EPS 생성능, 인가용화능력 및 항진균 능력이 다른 분리 균주에 비해 상대적으로 우수하였다(Table 2). 본 연구에서 YM23 균주는catalase 활성능력을 보유하고 있었는데, 동일한 속의 Arthrobacter nicotinovorans JI39 또한 catalase에 대해 양성 반응을 보였다[44].

YM33 (Accession no. PQ136100) 균주의 경우 Streptomyces sp.와 높은 유사도(99.64%)를 보였으며 중금속 내성을 보유한 것으로 알려져 있었다[45]. 이전 선행 연구에서, Streptomyces rapamycinicus와 Streptomyces cyaneus 모두 52.20 mg/kg 농도의 Cd로 오염된 토양에서 내성을 지니고 생장할 수 있었다고 보고되었다[45]. YM33 균주는 siderophore 활성과 DPPH 라디칼 소거능력이 우수하였는데 동일한 속의 Streptomyces fradiae MM456M-mF7 균주의 경우 Siderophore 생성능력을 보유하고 있다고 보고하였으며[46], Streptomyces cyaneofuscatus는 ascorbic acid (양성 대조군)에 비해 240배 높은 수준의 DPPH 라디칼 소거 활성을 보였다[47].

PGP 활성 및 항진균 능력이 가장 우수한 Arthrobacter sp. YM27의 Cd 내성능

2차 선별한 6종 세균 중에서 PGP 활성 및 항진균 활성이가장 우수한 Arthrobacter sp. YM27 균주의 생장에 미치는카드뮴의 영향을 평가한 결과를 Fig. 3에 도시하였다. 1/10 LB 배지에 100 μM Cd를 첨가한 경우 거의 생장하지 않았고(Fig. 3A), Cd 농도가 증가함에 따라 배가 시간이 증가하고 비생장속도가 감소하였다(Fig. 3B). YM27 균주의 비생장 속도는 0−50 μM에서 0.992−5.48 h-1였으나 100 μM Cd 함유 배지에서 YM27 균주의 비생장속도는 50 μM Cd 함유 배지의 비생장속도의 1/25 수준으로 100 μM 이상의 농도에서는 생장이 저해되었다. EC50은 균주의 생장을 50% 저해하는 중금속의 농도를 나타내는데, YM27 균주에 대한 Cd의 EC50 값은 4.38 ± 0.50 μM이었다. 유사한 선행 연구에서, 각각 23, 54 및 158 μM Cd 함유 배지에서 Arthrobacter sp. PGP41을 생장여부를 측정한 결과 Cd 농도가 증가함에 따라PGP41의 생장이 저해되었다고 보고하였다[48]. Arthrobacter sp.에 속하는 균주 ST11의 Cd의 EC50은 2.01 μM였고[49],이는 YM27의 EC50인 4.38 μM의 1/2수준에 해당하는 수치로, YM27의 카드뮴 내성이 우수함을 알 수 있다.

Figure 3.Microbial growth curves of strain YM27 in liquid medium (1/10 LB) supplemented with (A) Cd (0-500 μM) concentrations incubated at 35℃ for 53 h. The specific growth rate and doubling time of strain YM27 in the liquid medium (1/10 LB) amended with (B) Cd (0-500 μM).

중금속 오염 토양 내 기장 발아를 위한 Arthrobacter sp. YM27의 접종 효과

기장은 Cd, Pb 및 Ni을 식물체 내에 축적하는 과축적 식물 중 하나로, 중금속으로 오염된 토양의 식물 복원에 효과적으로 작용하는 것으로 알려져 있다[50]. Cd 및 Pb는 주로뿌리와 잎 기관의 세포벽에 고정되며, Ni는 세포 내에 축적되는 형태로 존재한다[50]. 또한 Arthrobacter 속 세균은 본연구 결과와 동일하게(Table 2), 대표적인 PGPB로 다양한작물의 성장을 유도하는 것으로 잘 알려져 있다[43]. 특히,중금속 토양 하에서 이러한 PGPB의 접종은 종자의 발아율을 개선해 식물의 성장을 돕고, 발아 후 식물의 성장은 토양내 중금속 스트레스를 완화할 수 있다[8].

이전 연구에서 PGPB가 중금속 오염 토양 내 기장 종자 발아에 미치는 영향에 대해 밝혔으며 발아율을 향상시킨다는연구결과가 보고되었다[3,8,51]. 본 연구에서 중금속으로 오염된 토양 내 기장의 발아 및 성장인자에 미치는 균주 접종영향에 대한 결과를 Fig. 4에 도시하였다. 기장만 식재한 무처리 조건에 비해 YM27 균주를 접종한 조건에서 기장의 발아와 성장이 우수한 것을 확인할 수 있었다(Fig. 4A−E). 발아율은 무처리 조건에서는 35.24%, YM27 균주를 접종한 조건에서는 46.19%로, 균주를 접종했을 때의 발아율이 식물만식재했을 때보다 약 1.3배 더 우수하게 나타났다(Fig. 4A).

Figure 4.The effect of PGPR inoculation on seed germination of (A) Panicum after 10 days of exposure to smelter soil. The plant growth parameters of Panicum after 10 days of exposure to smelter soil. (B) SPAD value; (C) Shoot length and root length; (D) Fresh weight and (E) Dry weight of Panicum. Error bars indicate standard errors. Solid lines indicate the medium and dotted lines indicate the average.

엽록소는 광합성의 주요 색소로, 식물의 건강과 성장 상태를 반영하기 때문에 식물의 성장을 평가하는 주요 성장지표로 사용된다[52]. 엽록소 함량이 높을수록 광합성이 활발히일어나며, 이는 식물의 성장과 생리적 활력을 나타내는 것을의미한다[52]. Fig. 4B에서 도시한 바와 같이 엽록소 함량 측정 결과, YM27 균주를 접종한 조건(24.58 SPAD)이 무처리조건(22.45 SPAD)에 비해 약 1.09배 높은 것으로 나타났다. 본연구와 유사한 조건에서, Cd 오염 토양 내 식재된 유채(Brassica napus)의 근권에 IAA 생성, siderophore 활성, 인가용화 및 ACC deaminase 활성을 보유한 Arthrobacter sp. SrN1의 접종은 엽록소 함량을 무처리 조건에 비해 약 1.2배높은 수준으로 증가시켰다[53]. 반면 유사한 선행 연구에 따르면, Arthrobacter pokkalii 균주를 산딸기(Rubus sp.)에 접종했을 때 접종하지 않은 조건에 비해 오히려 약 7/10 수준으로 감소하였다[54].

발아 종료 후 기장의 줄기 길이를 측정한 결과, YM27 균주를 접종한 조건의 줄기 평균 길이는 6.28 cm 수준으로 무처리 조건(4.30 cm)에 비해 약 1.5배 높은 수준이었다(Fig. 4C).

마찬가지로 YM27 균주를 접종한 조건의 뿌리 길이도 무처리 조건에 비해 유의미하게 길었으며(p < 0.05), 약 1.6배높은 수준으로 각각 7.06 cm 및 4.39 cm의 평균 뿌리 길이를 나타냈다(Fig. 4C). 우리 연구와 유사하게, IAA 및siderophore 생성능을 보유한 Arthrobacter sp. KSD16, KSD33 및 KSD36은 녹두의 뿌리 길이를 각각 52.4%, 109.5% 및 42.9% 증가시켰다[55]. 이를 통해 Arthrobacter속 균주는 녹두의 뿌리 발달 증진에 효과적인 역할을 수행할 수 있었다고 보고하였다[55]. 또한 EPS를 생성하고 식물병원성 균주에 대해 항균 활성을 보유한 Arthrobacter sp. GN70의 접종은 접종하지 않은 조건에 비해 약 2배 이상의벼의 줄기 및 뿌리 성장을 유도하였다[56].

기장은 바이오 에탄올 생산과 같은 에너지 작물로의 잠재력이 있어 바이오매스 연구가 다양하게 진행되고 있다[57].특히 기장 바이오매스는 재생 에너지 생산을 위한 잠재적인원천이 될 가능성이 높은 것으로 알려져서 바이오매스 함량을 촉진하는 것이 중요하다[58]. Fig. 4D와 4E에 도시한 바와 같이, YM27 접종은 줄기와 뿌리의 생중량을 모두 유의미하게 증가시켰다(p < 0.05). 기장의 생중량은 YM27 균주를 접종한 조건의 줄기(0.35 ± 0.06 g)와 뿌리(0.06 ± 0.02 g)가 무처리 조건의 줄기(0.21 ± 0.08 g)와 뿌리(0.03 ± 0.01 g)보다 각각 1.67배 및 2배 높은 수준이었다(Fig. 4D). 건중량또한 YM27 균주를 접종한 조건의 줄기(0.04 ± 0.01 g)와 뿌리(0.05 ± 0.02 g)가 대조군의 줄기(0.02 ± 0.01 g)와 뿌리(0.03 ± 0.01 g)에 비해 각각 2배 및 1.67배 높았다(Fig. 4E).본 연구와 유사하게, 인산 가용화능력을 보유한 Arthrobacter ureafaciens 균주를 밀에 접종했을 때 바이오매스(줄기와 뿌리의 생중량 및 건중량)가 대조군에 비해 약 1.5배 이상 유의한 수준으로 증가하였다(p < 0.05, [59]).

본 연구에서 YM27은 Cd의 존재 하에서 기장의 발아와 성장을 개선하는 상당한 능력을 보였는데(Fig. 4A, C and D),성장인자를 바탕으로 발아지수를 산출한 결과는 439.68% 였다. 이는 A. ureafaciens DnL1-1을 밀에 접종했을 때 비접종 조건과 비교하여 발아지수에 유의한 영향을 미치지 않았다는 선행 연구와 상반된 결과를 보여 본 연구에서 분리한YM27 균주의 생물 비료로의 잠재력을 증명하였다[59]. 최근식물종의 활력 지수(VI)가 묘목 성장에 대한 중금속의 식물독성을 평가하는 데 널리 사용되고 있다[60]. VI은 식물 성장이 물리화학적 특성을 나타내는 토양 환경에 크게 의존한다는 전제를 기반으로 하여 발아율 및 식물체의 길이를 사용하여 개발되었다[61]. 본 연구에서의 활력지수는 무처리조건에서 7.40, YM27 균주를 접종한 조건에서 16.17로, 균주를 접종했을 때의 활력지수가 약 2.2배 높았다. 선행 연구에서 Cd 오염 아래 Arthrobacter sp. EC10 균주를 접종한토끼풀(Trifolium repens)의 활력 지수가 증가한 것을 확인할 수 있었다[59]. 반면 Arthrobacter ureafaciens를 접종하였을 때 밀의 종자 발아 지수와 활력 지수에 유의미한 영향을 미치지 않았다(p > 0.05, [59]). Arthrobacter 속에 속하는 YM27은 본 연구에 존재하는 Cd 오염 조건에서 기장의 발아와 성장을 개선하고 우수한 활력지수를 나타내었다. 중금속 오염 토양에서 기장의 발아 향상과 초기 생장 활력을 유도한 결과는 YM27 균주가 보유한 식물 생장 촉진 능력과 함께 중금속 독성으로 인한 산화 손상을 방해할 수 있는 활성산소종 생성으로부터 항산화 효소 활성 능력을 통해 식물의 방어 시스템을 형성하였기 때문으로 사료된다. 유사한 선행연구에서, DPPH 라디칼 소거 활성 능력을 보유한 Enterobacter sp. S16-3와 Pseudomonas sp. C16-2O를 접종하였을 때 Brassica napus L.의 줄기와 잎의 항산화 능력을증가시켜 식물의 초기 생장을 유도하였다는 것이 입증되었다[62].

본 연구에서는 제련소 주변 토양에서 Cd에 내성을 지닌세균을 순수 분리하여, 그들의 식물 성장 촉진능력 및 항진균 활성능력을 평가한 결과, 지속 가능한 농업 발전과 중금속 오염 토양 복원을 위한 생물학적 적용 기술에 동시 적합한 균주로서 그 능력이 가장 우수한 Arthrobacter sp. YM27을 최종적으로 선별하였다. 특히 YM27 균주는 항진균 활성평가에서 식물 병원성 진균인 B. cinerea에 대해 높은 항균활성을 보였으며, 높은 IAA 생성능력과 EPS 생성능력을 동시에 보유하고 있었다. 또한, YM27 균주 접종에 의해 기장의 발아율이 증가하고 줄기와 뿌리의 성장이 촉진되는 것으로 확인되었으며, 바이오매스도 증가하였다. 본 연구결과는Arthrobacter sp. YM27가 중금속 오염 토양에서 기장 성장을 향상시키는 데 기여할 수 있으며, phytoremediation에 의한 중금속 오염 토양의 정화 효율을 높이는데 활용 가능함을 시사한다. 향후 YM27 균주를 실제 중금속 오염 토양에적용하여 식물 성장에 미치는 접종효과를 정량적으로 평가하고, 중금속 오염 토양 정화 효율에 미치는 영향을 장기간평가할 필요가 있다.

요약

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카드뮴(Cd)과 같은 중금속으로 오염된 토양은 식물 성장을 심각하게 저해한다. 본 연구에서는 제련소 주변의 토양에서 식물 성장 촉진 특성을 가진 34종의 중금속 내성 세균을분리하였다. 이 중에서 Arthrobacter sp. YM27을 선정하였으며, 이 균주는 indole-3-acetic acid, exopolysaccharide, 그리고 catalase 활성이 우수하였다. YM27 균주는 식물 병원성 진균인 Botrytis cinerea에 대해 72% 이상의 항진균 활성을 보였으며, Cd 농도가 50 μM까지 성장할 수 있고, 절반최대유효농도(EC50)는 4.38 ± 0.50 µM이다. YM27을 Cd로 오염된 토양(216.40 ± 4.10 ppm)에 접종했을 때, 기장(Panicum)의 발아와 성장에 미치는 영향을 조사하였다. YM27 접종 시기장의 발아율은 1.3배 증가하였고, 엽록소 함량은 1.09배 증가하였다. 기장의 줄기와 뿌리 길이는 각각 1.5배 및 1.6배 증가하였으며(p < 0.05), 생중량은 각각 1.67배 및 2배 증가하였다(p < 0.05). Cd 오염 하에서 기장의 발아지수는 440%에 도달하였고, 활력지수는 대조군에 비해 2.2배 향상되었다. 본 연구는 Cd 내성 Arthrobacter sp. YM27의 접종이 중금속 오염토양에서 기장의 발아율과 바이오매스를 증가시킬 수 있음을 확인하였으며, 식물 정화 기술 향상을 위한 귀중한 자원으로서의 잠재력을 제시한다.

Acknowledgments

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This research was supported by National Research Foundation (NRF) of Korea (2022R1A2C2006615), and Korea Foundation for Women in Science, Engineering and Technology (WISET) grant (WISET-2024-160) funded by the Korean government via the Ministry of Science and ICT (MISIT).

Conflict of Interest

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The authors have no financial conflicts of interest to declare.

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