Contact us
닫기
Article Search
닫기

Microbiology and Biotechnology Letters

Research Article(보문)

View PDF

Food Microbiology (FM)  |  Probiotics in Nutrition and Health

Microbiol. Biotechnol. Lett. 2024; 52(1): 1-14

https://doi.org/10.48022/mbl.2309.09001

Received: September 5, 2023; Revised: October 4, 2023; Accepted: October 12, 2023

양식 붉바리 장관에서 분리된 미생물의 프로바이오틱 잠재력 평가

Evaluation of the Probiotic Potential of Microorganisms Isolated from the Intestinal Tract of Cultured Epinephelus akaara

Young-Gun Moon1, Moon-Soo Boo2, Chi-Hoon Lee2, Jin-Kuk Park1, and Moon-Soo Heo1*

1Department of aquatic Biomedical Sciences, Jeju National University, Jeju 63243, Republic of Korea
2Fishing Coporation CR Co., Ltd., Jeju 63333, Republic of Korea

Correspondence to :
MoonSoo Heo,      msheo@jejunu.ac.kr

Abstract

Go to

This study focused on isolating and identifying strains from the gut of Epinephelus akaara cultivated in aquaculture facilities on Jeju Island. The aim was to evaluate the potential of utilizing these strains as probiotics for industrial applications. A total of 129 strains were isolated from the gut of E. akaara and screened based on their ability to create a clear zone of 10 mm or more in a preliminary antimicrobial activity test. Twelve strains were selected for further analysis, including bile resistance, acid tolerance at different pH levels, antioxidant activity, antibiotic susceptibility, and biochemical characteristics using the API kit. Through these characteristic experiments, eight strains (G1, G3, G15, G21, B1, B2, B3, B5) were identified as having potential as probiotics. Among these, the B group strains (B1, B2, B3, B5) exhibited significantly higher activity compared to the G group strains (G1, G3, G15, G21). Based on the phylogenetic analysis of the 16S rRNA gene sequences of the selected microorganisms, the strains were named as follows: B1 strain as Lactobacillus paracasei B1, B2 strain as Lactococcus lactis B2, B3 strain as Lactobacillus plantarum B3, B5 strain as Lactococcus lactis subsp. hordniae B5, G1 strain as Bacillus licheniformis G1, G3 strain as Bacillus velezensis G3, G15 strain as Brevibacterium frigoritolerans G15, and G21 strain as Bacillus pumilus G21.

Keywords: Epinephelus akaara, evaluation, intestinal tract, microorganisms, probiotics

Graphical Abstract


서론

Go to

Probiotics를 WHO (the World Health Organization)와FAO (the Food and Agriculture Organization of the United Nations)에서는 “적정량 섭취 시 숙주에게 유익한 효과를 주는 살아있는 미생물”이라고 정의하고 있다[1]. Probiotics의 어원을 해석하면 “for life (생명을 위하여)”란 뜻이며, 이는 “against life (생명에 반대하여)”인 항생제(antibiotics)와 반대되는 말이다. 항생제는 유해한 미생물을제거하기 위해 설계되고 이용하는 것이고, probiotics는 인체에 유익한 미생물을 의도적으로 제공하기 위한 것이다. Probiotics는 장내 미생물 집단을 건강한 생태로 안정화시키고 유해한 미생물의 증식을 억제하여, 장내미생물의 불균형상태인 dysbiosis를 예방하여 인체에 유익한 이점을 제공한다[2, 3]. Probiotics의 효과를 가지기 위해서는, 위장의 낮은pH와 장내에서 분비되는 소화효소에 대한 내성을 가지고 있어야 하고, 장내 유해균들에 대한 항균 활성, 항생제 내성이나 독성 유전자, 용혈 활성 등의 안전성 평가가 중요하다[4, 5]. 건강기능성 식품으로 사용되고 있는 probiotics 균주로는숙주에게 유용한 대사물질과 효소 능력을 가진 것으로 알려진 Lactobacillus, Bifidobacterium, Streptococcus, Bacillus등이 연구 보고되어 있다[6].

양식산 어류와 어업 활동으로 생산되는 수산물은 인류의건강에 있어 주요 단백질원과 필수 미량요소를 제공하고 있다. 최근 10년동안 수산양식(어류, 어패류, 해조류양식)업은세계적으로 식량생산 분야에서 가장 빠르게 성장하고 있으며, 소비되는 수산물의 30% 제공하고 있지만 집약적 양식과기후 변화로 인해 발생하고 있는 감염성 질병은 많은 경제적 손실을 초래하여 양식산업 발전의 큰 문제점으로 나타나고 있다. 감염성 질병은 병원성 미생물과 바이러스에 의해발생한다. 이러한 질병들을 제어하고 치료하기 위해 백신과항생제가 보편적으로 사용되어 있으며, 항생제가 보편적으로 사용되면서 항생제에 내성을 갖는 내성균이 출현하고, 양식어류 체내에 항생제 잔여물이 축적되며, 어류 면역 시스템이 약화 또는 파괴되는 등 환경과 인류건강에 해로운 영향을 가져오게 되었다. 이러한 이유로, 유럽에서는 수산양식에서 항생제의 사용이 금지되었고, 미국 등에서는 항생제 사용에 엄격한 제한을 두고 있다. 전 세계 양식 산업계에서는 양식어류 면역체계 강화 및 성장 개선 연구에 대한 관심이 증가하였고, 어류질병을 치료하거나 예방하기 위한 대체방법으로 면역반응을 자극하는 사료 첨가제 개발이 활발히 이루어져 probiotics, prebiotics, 영양 보조제등 친환경적이면서안정적인 첨가제등이 개발되었다. 다양한 사료첨가제(probiotics, prebiotics)가 양식어류와 갑각류에서 성장, 사료효율, 면역체계의 개선에 효과적이라는 것이 밝혀졌다[7]. 그리고prebiotics는 “장 내에 존재하고 있던 한정된 미생물 종의 성장과 활성을 자극함으로써 숙주 건강에 이로운 작용을 하는소화되지 않는 성분이다.”고 밝혀졌다[8]. 어류와 갑각류에서prebiotics에 대한 다양한 연구들은 다음과 같은 매개 변수들을 증명해왔다: 성장효과 및 항산화 활성[9, 10], 병원성 미생물에 대한 항균 및 저항력[9, 11]과 대체보체활성(ACH50)같은 선천적 면역 매개 변수, 리소자임 활성, 혈구응집활성 [12], 식세포 활성(phagocytic burst). 이러한 연구들은 면역자극제로서 prebiotics를 사료 첨가제로 사용하면 양식 현장에서 발생하고 있는 다양한 질병들을 관리, 예방하기 위해유효한 대체방법임을 확인시켜 주고 있다. 지구 환경에는 다양한 미생물이 존재하며, 자연 환경을 비롯한 주변의 생물권과 긴밀하게 연결되어 있다. 하지만 생리, 생육, 효능 등을파악하고 있는 미생물은 극히 일부에 지나지 않는다. 미생물들은 환경에 적응하여 생장하는 과정에서 다양한 효소 들을생산하며, 인류는 살아오면서 수많은 경험을 바탕으로 다양한 미생물의 효능과 유용성을 파악하여 활용해 오고 있었다. 세계적으로 많은 연구자들은 여러 환경 조건과 다양한 시료에서 미생물을 발견하고, 인류가 필요로 하는 분야에 활용하고자 지속적인 연구가 이루어지고 있다[13−16]. 본 연구에서는국내의 청정지역으로 알려진 제주도에서 제주 토착어류인붉바리를 생산하여 사육하고 있는 양식장에서 붉바리 자치어 장관에서 미생물을 분리하여 효소 활성, 항산화 활성, 담즙내성, 내산성 등을 확인하여 양식장에서의 probiotics 활용가능성을 확인하였다.

재료 및 방법

Go to

실험어

본 실험에서 장내 미생물을 분리하기 위한 실험어는 제주도에 소재하고 있는 씨알 주식회사에서 생산하여 먹이생물(로티퍼, 알테미아) 섭이 단계가 끝나고 미립자 사료를 먹이고 있는 붉바리 자치어(12 ± 2.1 cm, 12.5 ± 2.3 g)를 대상으로 하여 실험을 진행하였다.

붉바리 장관에서 미생물 분리

붉바리 자치어 장관에서 미생물을 분리하기 위해서 사육중인 붉바리 자치어를 2일간 절식시킨 후 장을 clean bench (JSCB-1800SB, Republic of Korea)에서 무균적으로 적출한뒤 0.85% 멸균 생리 식염수에 2회 세척한 뒤, 장관 중 중장부위 1 g을 절개(Fig. 1)하여 0.85% 멸균 생리 식염수 9 ml이 담긴 15 ml conical tube 옮겨 담아 sterile homogenizer pestle로 균질화 하여 단계 희석한 후 1.5% NaCl이 첨가된brain heart infusion agar (Difco, USA), Lactobacilli MRS agar (Difco), YM agar (Difco)와 1.5% NaCl이 첨가되지 않은 marine agar (Difco)에 평판 도말법을 이용하여 28℃에서48시간 배양하였다. 각각의 배지에 나타나는 균의 모양, 색깔 등 형태학적 모습을 관찰하여 순수분리 하였으며, 분리된미생물은 50% (v/v) 멸균 glycerol으로 stock을 제조하여, -80℃에 보관하면서 실험에 사용하였다.

Figure 1.Epinephelus akaara digestive tract.

붉바리 장내미생물의 16S rRNA 염기서열분석

붉바리 장관에서 분리된 미생물은 Genomic DNA Extraction Kit (Bioneer, Republic of Korea)로 DNA를 추출하고, genomic DNA 1 μl와 27F/1492R universal primer 각각 0.5 μM primer와 DNA polymerase, dNTPs, reaction buffer가 포함된 20 μl PreMix (Bioneer)를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응 조건은 intial denaturation (95℃, 2분), denaturation (95℃, 30초), annealing (55℃, 30초), extension (72℃, 30초)으로 총 30 cycle로 수행한 후 마지막으로 다시한번 extension (72℃, 5분)하였다. 증폭된 PCR products는Red safe (Intron, USA)가 첨가된 1% agarose (Promega Co., USA) gel에서 전기 영동하여 확인하였다. 다음 Accuprep TM PCR purification Kit (Bioneer)를 사용하여 PCR products에 남은 primers, nucleotides, polymerase, salts를 제거 및 정제하고 elution buffer (10 mM Tris-Cl, pH 8.5) 30 μl로elution 하였다. PCR products의 염기서열의 분석은 (주)마크로젠(Republic of Korea)에 의뢰하여 결과를 얻었다. 분석된염기서열을 Molecular Evolution Genetics Analysis (Mega) software version 7.0 프로그램을 이용하여 결정된 염기서열을 확인하고, 미국 국립생물정보시스템인 NCBI (National Center for Biotechnology Information)의 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)search program을이용하여 GenBank database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)의DNA sequencing data와 유사한 염기서열을 비교하였으며,가장 근연속 또는 종(closest species)을 나타나는 서열을 확인하였다.

pH 농도별 내산성 및 내담즙성 측정

선별된 미생물의 내산성 평가는 pH 3.0−8.0 (in 5 N HCl)으로 0.5 농도 단위로 조정한 100 ml BHI broth (Difco)와MRS broth (Difco)에 위산에 대한 저항성을 확인하기 위하여 각각의 균주(1.2 × 105 CFU/ml)를 100 μl를 접종하여100 rpm, 28℃에서 24시간동안 배양한 후 colony를 계수하였다. 내담즙성 측정은 Walker and Gilliland [17]의 방법에따라 균을 600 nm에서 optical density (OD) 값이 0.8이 되도록 배양한 후 0.3%의 oxgall (Neogen)을 첨가한 TSB (NaCl 1.5% 첨가) 배지에 접종하여 28℃에서 125 rpm으로 배양하면서 12시간 동안 3시간 간격으로 OD 값을 측정하였다. 대조구는 oxgall을 첨가하지 않은 TSB (NaCl 1.5% 첨가) 배지에 미생물을 배양하여 측정하였다.

DPPH radical 소거활성

DPPH법은 α-tocopherol, ascorbate, flavonoid 화합물, 방향족 아민류, maillard형 갈변 생성물질, peptide 등의 항산화 활성을 나타내는 생리활성 물질에 의해 환원됨으로서 짙은 자색이 탈색되는 정도에 따라 항산화 효과를 전자공여능으로 측정하는 방법으로 항산화제 탐색에 일반적으로 이용되는 방법으로 알려져 있다. DPPH radical 소거활성은4.0 × 10-4 M DPPH 용액 2 ml와 48시간 배양된 분리균주의배양액을 14,000 ×g에서 15분간 원심하여 상층액과 균체를분리하였다. 분리한 상층액은 0.45 μm syringe filter (Whatman, UK)를 이용하여 여과한 후 농도별(0.1%, 0.5%, 1.0%, 2.0%)로 제조 혼합한 후, spectrophotometer (Hanson OPRON-3000, Republic of Korea)로 525 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조구로 천연항산화제인 ascrobic acid는 0.5% (w/v)의농도로 제조한 후 제조된 DPPH 용액 2 ml와 대조구액 1 ml씩을 혼합한 후 흡광도를 측정하였다. 전자 공여능(Electron donating ability, EDA)은 시료첨가구와 흡광도 차를 측정하여 백분율로 표시하였다.

EDA(%) = (대조구 흡광도 – 시료 첨가구 흡광도)/대조구 흡광도 × 100

Hydroxyl radical 소거활성

Hydroxyl radical(·OH)은 산소종 중 반응성이 매우 강하며 지질 산화를 개시하고 DNA 손상 및 돌연변이를 유발하는 물질로 알려져 있다. Hydroxyl radical은 생체의 대사과정에서 생성되는 지질의 과산화물이나 H2O2가 Fe2+나 Cu2+ 이온의 존재 하에서 생산되며 가장 독성이 강한 free radical이므로 이 라디칼을 소거하는 정도를 측정한다[19, 22]. 배양액의 hydroxyl radical (OH) 소거활성능을 조사하기 위해2-deoxyribose oxidation method [18] 방법을 변형하여 측정하였다. 시험관에 10 mM FeSO4/EDTA 용액 0.2 ml, 10 mM 2-deoxyribose 0.2 ml, 48시간 배양된 배양액을 14,000 ×g에서 15분간 원심하여 상층액과 균체를 분리하였다. 분리한 상층액은 0.45 μm syringe filter (Whatman)를 이용하여 여과한 후 농도별로(0.1%, 0.5%, 1.0%, 2.0%) 제조 혼합하고0.1 mM phosphate buffer (pH 7.4) 1 ml, 10 mM H2O2 0.2 ml를 가하고 37℃에서 4시간 동안 반응시킨 후, 2.8%TCA (trichloroacetic acid) 용액 1 ml를 가하여 반응을 중지시켰다. 그 후, 1.0% TBA (thiobarbituric acid) 용액 1 ml를 가하여 100℃에서 10분간 가열시킨 후 급속히 냉각시켜532 nm에서 흡광도를 측정하였으며 시료에 대한 대조구로천연항산화제인 ascrobic acid는 0.5% (w/v)의 농도로 제조한 후 측정하였다. ·OH 소거활성은 HSA (hydroxyl radical scavenging ability)로 표기하였으며 다음과 같은 식으로 계하였다.

HSA(%) = {1 − [(absorbance of sample at 532 nm)/(absorbance of control at 532 nm)]} × 100

SOD(Superoxide Dismutase) 유사활성 측정

Superoxide radical (O2−) 소거활성능은 알칼리 상태에서pyrogallol의 자동산화에 의한 발색을 이용한 Eugene [19]와Marklud [20]의 방법에 따라 측정하였다. 본 실험에서 사용된 시료는 50 ml BHIB에 28℃에서 48시간 배양된 배양액을 14,000 ×g에서 15분간 원심하여 상층액과 균체를 분리하였다. 분리한 상층액은 0.45 μm syringe filter (Whatman)를 이용하여 여과한 후 실험하였다. 50 mM phosphate buffer 2.61 ml, 3 mM pyrogallol 90 μl를 첨가하여 30초 간격으로 6분간 측정하여, standard를 측정하였으며, 그 후의시료는 50 mM phosphate buffer (pH 8.24) 2.61 ml와 시료는 농도별로(0.1%, 0.5%, 1.0%, 2.0%) 첨가 후 3 mM pyrogallol 90 μl를 첨가하여 325 nm에서 30초 간격으로 6분간 측정하였으며 superoxide radical 소거활성값은 다음과같은 식에 의해서 나타내었다.

Superoxide radical scavenging activity (%) = (a − b)/a × 100

a = standard의 반응전과 반응후의 흡광도 차이

b = sample의 반응전과 반응후의 흡광도 차이

미생물의 항생제 감수성

항생제 감수성 실험은 디스크 확산법(Disc diffusion method)으로 확인하였다. 28℃에서 BHIB 및 MRS broth로24시간 배양한 균(1.8 × 107 CFU/ml)을 1.5% NaCl을 포함하는 Mueller Hinton (MH, Difco) 배지에 100 μl씩 도말한후 항생제 disc를 올려놓고, 28℃에서 24시간 배양하여 나타난 생육 저해환의 크기를 측정하였고, 사용한 항생제 disc (Oxoid, England)는 Amoxicillin (AMC30), Tetracycline (TE30), Oxytetracycline (T30), Chloramphenicol (C30), Cephalothin (CF30), Nalidixic acid (NA30), Ciprofloxacin (CIP30), Novobiocin (NB30), Doxycycline (D30), Sulfadiazine (SD25), Neomycin (N30), Erythromycine (E15)이며, clear zone은 paper disc의 직경도 포함하였다. 비교 균주로 양식어류에 출혈성 패혈증을 일으켜 막대한 손실을 가져오는 어류질병원인 세균인 Listonella anguillarum (KCTC2711)을사용하였다.

API Kit을 이용한 생리화학적 특성 분석

분리된 균주의 biochemical test, assimilation test 그리고fermentation test를 하기 위해 API 20NE, API 50CH, API ZYM microtest system(bioMerieux)을 이용하여 생리,생화학적 특성을 조사하였다.

결과 및 고찰

Go to

미생물의 분리 및 동정

붉바리 자치어 장관에서 분리된 미생물은 반복적인 단일colony가 나올 때까지 계대배양을 통해 순수 순리를 진행하여 동일 배지상에서 유사한 colony를 제외하고 총 129 colony를 선택하여 보존 균주를 제조하여 -80℃에 보존함과 동시에 염기서열 분석을 진행하였다. 16S ribosomal RNA PCR로 증폭된 129종은 GenBank database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)의 DNA sequencing data의 identify을 통해11과(Family) 14속(Genus)으로 분석되었다(Table 1). 순수분리된 129균주를 대상으로 1차적으로 자체적인 간이 항균활성 실험을 통해(data not shown) clear zone이 10 mm 이상되는 12균주(Table 2)를 선별하여 특성 실험에 이용하였다.

Table 1 . Classification of microorganisms isolated from the intestine of the Epinephelus akaara.

FamilyGenusIsolated no.
BacillaceaeBacillus70
StaphylococcaceaeStaphylococcus1
StreptococcaceaeLactoccous4
LactobacillaceaeLactobacillus26
BrevibacteriaceaeBrevibacterium2
MicrobacteriaceaeMicrobacterium7
Glutamicibacter10
Micrococcus2
RhodobacteraceaeParacoccus1
KangiellaceaeKangiella1
ShewanellaceaeShewanella1
PseudoalteromonadaceaePseudoalteromonas1
VibrionaceaePhotobacterium1
Vibrio2


Table 2 . NCBI blast search results for 12 microbial isolates from the intestinal of Epinephelus akaara.

Isolate codeClosest relative (obtained from BLAST search)Identity (%)Length (bp)
G1Bacillus licheniformis DSM 1399.161382
G3Bacillus velezensis CBMB20599.441445
G15Brevibacterium frigoritolerans DSM 880199.511401
G21Bacillus pumilus ATCC 706199.651403
J2Paracoccus marcusii MH199.401309
J7Micrococcus yunnanensis YIM6500499.111339
R8Micrococcus aloeverae AE-699.421353
R13Bacillus tequilensis 10b99.511213
B1Lactobacillus paracasei R09499.581415
B2Lactococcus lactis NBRC1 0093399.431385
B3Lactobacillus plantarum JCM114999.511416
B5Lactococcus lactis subsp. hordniae NBRC 10093199.361382


pH 농도별 내산성 및 내담즙성

미생물의 probiotics 조건을 갖추기 위해서는 위장의 pH 3 이하의 산성조건과 담즙 분비의 환경조건에 생존할 수 있어야 장관까지 도달하여 기능성을 발휘할 수 있다[21]. 본 연구에서 선발된 12종의 미생물의 내산성을 측정한 결과는Table 3와 같다. 본 연구에서는 음식물을 섭취할 경우 pH 3.0이상으로 중화되는 것을 고려하여 pH 3.0부터 분리된 미생물들의 내산성을 측정하였다. probiotics의 조건 중 내산성은 생균을 사육수조 및 사료에 흡착하여 투여하였을 때 pH가낮은 장기인 위에서 정착하여 생존하여야 활성을 유지할 수있기 때문에 매우 중요한 지표 중 하나이다. B1, B2, B3, B5균주는 pH 3.0에서 약하게 성장하는 모습이 보였으며 pH 3.5에서는 성장이 확인되어 내산성을 가지고 있음이 확인이 되었으며, J2, J7, R8, R13 균주는 pH 4.0−4.5에서 감수성이높은 것으로 확인되었다. G1, G3, G15, G21 균주는 pH 4.5에서 성장이 확인되어 B 균주보다는 낮으나 G 균주에서도내산성이 확인이 되었다. 담즙은 보통 pH 7.8−8.6으로 알칼리성이나 위액에 의해 중화가 이루어지게 된다. 0.3%의oxgall이 첨가된 TSB 배지에서 G1 균주는 대조군과 비교했을 때 3시간 후에 균의 증식이 다소 감소하는 걸 확인할 수있었으며, 6시간 후에는 oxgall이 첨가되지 않은 TSB(대조구) 배지에서의 성장과 비교하였을 때 실험구(oxgall 첨가)에서 50%로 감소하는 경향이 나타났으며, 9시간이 경과하였을 때는 38%로 감소하였으나 대조구와 유사한 증식 패턴을 보였다(Fig. 2). G3, G15, G21 균주 역시 6시간 후 45%, 49%, 50%로 증식이 감소하는 걸 확인하였으며, 9시간 경과 후에는 39%, 39%, 33%로 감소하였으나 G1 균주와 마찬가지로대조구와 유사한 증식 패턴을 나타내었다. J2, J7, R8, R13균주는 6시간 경과 후 63%, 50%, 55%, 70%로 균의 증식 감소폭이 높은 것이 확인이 되며, 9시간 경과 후에는 50%, 49%, 54%, 48%로 감소하였다. B1, B2, B3, B5 균주 역시대조구와 비교했을 때 3시간 후에 증식이 감소하는 것을 확인할 수 있었으며, 6시간 후에는 oxgall이 첨가되지 않은 대조구에서의 성장과 비교하였을 때 실험구에서 48%, 48%, 46%, 47%로 감소하는 경향이 나타났으며, 9시간이 경과하였을 때는 34%, 38%, 37%, 39%로 감소하였으나 대조구와유사한 증식 패턴을 나타내었다(Fig. 2). 붉바리 장에서 분리되어진 균주들은 인공담즙에 의해 성장이 억제되기는 하나,시간 경과에 따라 처음 투여 농도 보다는 증가하는 양상을보이고 있어 담즙이 있는 곳에서도 사멸하지 않고 생존 가능하다고 판단된다.

Table 3 . Microbial growth experiment results based on pH concentrations.

pHG1G3G15G21J2J7R8R13B1B2B3B5
3.0--------w*www
3.5--------++++
4.0-*-------++++
4.5+*+++----++++++++
5.0++++++++++++++++
5.5++++++++++++++++
6.0++*++++++++++++++++++++++++++
6.5++++++++++++++++++++++++++++
7.0+++++++++++++++++++++++++++++
7.5+++*+++++++++++++++++++++++++++++
8.0++++++++++++++++++++++++++++++++

*w; weak growth, -; not growth, +; <103 CFU/ml, ++; <105 CFU/ml, +++; >108 CFU/ml

Figure 2.Bile tolerance absorbance (600 nm) value of isolated microorganisms.

DPPH radical 소거활성

항산화 물질은 free radical에 전자나 수소를 공여하여 복합체를 만들고, DPPH는 항산화성 물질로부터 전자, 수소를받아 불가역적으로 안정한 분자를 형성하므로, 전자공여능(electron donating ability, EDA)으로부터 항산화 활성을 추정할 수 있다. 본 실험에서 대조구로 사용된 천연 항산화제인 ascrobic acid는 항산화 작용으로 반응시간과 함께525 nm에서 짙은 자색을 가지는 DPPH 용액의 흡광도가 점차적으로 감소하는 것으로 나타났다. DPPH법에 의한 전자공여능을 측정한 결과 미생물 배양 상등액의 농도에 따라 농도 의존적으로 활성이 증가하고 있음을 확인할 수 있었다(Fig. 3A). 균주에 따른 활성 결과를 보면 B3>B5>B1>B2>G3>G1>G21>G15>R13>R8>J2>J7 순으로 활성도를 나타내고 있다(Fig. 3A). 대조구로 사용한 천연 항산화제인ascrobic acid의 농도는 0.5%(w/v)였으며 분리 미생물의 항산화 활성능은 천연 항산화제에 비해 낮게 나타났지만 일반적으로 실험에 사용되는 항산화제의 농도(0.05%, w/v)에 비교해 보았을 때 높은 항산화 활성을 가지고 있는 것으로 확인되었다. 또한 배양 상등액상의 정제되지 않은 상태로서50% 이상의 뚜렷한 활성을 나타내었기 때문에 미생물 천연항산화제로서의 가능성이 있다고 생각된다[22, 23].

Figure 3.Antioxidant activity of the isolated microorganisms. DPPH radical scavenging activity (3A), Hydroxyl radical scavenging activity (HAS, 3B), Superoxide Dismutase(SOD, 3C).

Hydroxyl radical 소거활성

본 실험에서는 in vitro 상에서 Fe2+ 존재 시 발생되는hydroxyl radical에 의해 2-deoxyribose의 손상여부를 조사한 결과 붉바리 장에서 분리된 균주 중 B5 균주가 2.0% 농도에서 81%로 가장 높은 HSA활성을 나타냈으며, 천연 항산화제인 ascrobic acid (0.5% (w/v))는 89%에 HSA 활성을나타내었다. 균주에 따른 HSA 활성 결과를 보면 B5>B3>B1>B2>G21>G1>G13>J7>R8>J2>R13>G15 순으로나타났다(Fig. 3B). 붉바리 장에서 분리된 미생물의 HSA 활성은 균주 배양 상등액에 포함되어 있는 물질이 2-deoxyribose와hydroxyl radical과의 반응보다 더 빨리 일어나 2-deoxyribose의 변성을 억제하는 것으로 사료된다[24]. 또한 HSA는antioxidant 특성뿐만 아니라 pro-oxidant 특성을 조사하는방법으로도 널리 사용되고 있으며, 본 연구에서는 항산화 작용을 하는 물질들을 정확하게 규명한 것은 아니지만 높은 항산화능을 나타내는 것을 확인할 수가 있었다.

SOD(Superoxide Dismutase) 유사활성

생체내의 항산화 방어기구 중 효소적 방어계의 하나로서superoxide radical을 환원시켜서 활성산소로부터 생체를 보호하는 superoxide radical 소거활성을 pyrogallol 자동산화로 생성되는 superoxide anion radical을 소거 여부로 확인하였다(Fig. 3C). 붉바리 장에서 분리된 12균주의 48시간 배양 상등액을 가지고 SOD 유사활성을 측정 한 결과 B5 (57%), B3 (54%), B1 (52%), B2 (52%), G21 (35%), G1 (34%), G3 (34%), R13 (34%), G15 (33%), R8 (32%), J2 (32%), J7 (31%) 순으로 항산화능을 나타내었으며, 천연 항산화제인ascrobic acid는 78%의 항산화능을 나타내었다. Superoxide radical은 호기적 대사기관에서 여러 가지 생화학적 반응으로 생성되며, 주로 세포막 지질의 불포화 지방산과 반응하여지질 과산화물을 생성하므로 세포손상을 초래한다고 알려져있다[25]. 생체는 이러한 지질 과산화에 대한 반응체계로서SOD에 의하여 superoxide radical을 H2O2로 바꾸며, 다시H2O2는 catalase와 glutathione peroxidase의 작용에 의해H2O로 환원되므로 이들 효소계의 반응에 의해서 free radical로부터 생체를 보호할 수 있다[25, 26]. 본 실험에서는 장내미생물 배양액에서 최대 57%, 최소 31% 정도의 superoxide radical 소거활성을 나타내었다. 장내 미생물 배양액에 대한항산화 실험결과를 통하여 붉바리 장관에서 분리된 미생물에서 활성능에 차이는 있지만 DPPH radical에 대한 전자공여능, hydroxyl radical 소거능과 superoxide radical 소거능을 가진 것으로 확인이 되었다. 특히 활성산소 radical에 대한 소거활성에 있어 독성이 보다 큰 hydroxyl radical 소거활성이 superoxide radical 소거활성 보다 높아 유용한 항산화제의 개발 가능성을 보여주고 있다.

항생제 감수성

항생제 감수성 실험은 유용미생물 장내에서 정착 또는 생존해야 하기 때문에 중요한 조건으로 작용할 수 있다. Probiotics 일부 균주는 항생제 내성 유전자를 지니고 있다.항생제 저항성의 문제는 Lactococcus, Leuconostoc, Lactobacillus 속 및 Bifidobacteria에서도 나타나고 있으므로 Probiotics로 이용되는 균주의 항생제 내성에 대한 연구가 수행되어야 한다[27]. 또한 probiotic 균주 선별에 있어서도 매우 중요한 요소로 적용될 수 있다. 12종의 시판용 항생제에 대한 내성을 확인한 결과(Table 4) 비교 균주인Listonella anguillarum은 4종(CF30, NA30, SD25, N30)의 대해서 항생제 내성을 나타내었다. G1, G3, G15, G21 균주에서는 4종(AMC30, NA30, SD25, N30)의 항생제에 내성을 보였으며, G21 같은 경우는 5종(AMC30, CF30, NA30, SD25, N30)의 내성을 나타냈으며, J2, J7, R8, G13 균주는Sulfadiazine에 대해서만 내성을 나타내었다. B1, B2, B3, B5 균주는 5종(CF30, NA30, NB30, SD25, N30)의 항생제에 내성을 나타냈으며, B1 균주는 6종(AMC30, CF30, NA30, NB30, SD25, N30) B3 균주는 7종(AMC30, CF30, NA30, NB30, SD25, N30, E15)의 항생제에 내성을 나타냄을 확인하였다. 항생제 내성을 나타내는 균주에 대해서는 질병 치료기간에 항생제 처리를 하여도 일정기간 장내에서 정착하여 생존할 수 있다고 생각된다. 그러므로 항생제 내성을나타내는 장내 미생물은 차후 천연 항생제 및 면역 증강제로도 활용이 가능하리라 판단된다[28].

Table 4 . Antibiotic susceptibility test results. (clear zone diameter; mm)

DiscL. anguillarum**G1G3G15G21J2J7R8R13B1B2B3B5
AMC30*12.00013.0013.014.513.512.008.5008.50
TE3029.015.016.018.013.027.026.024.029.012.011.08.5010.0
T3027.016.015.516.514.523.021.018.021.513.09.0011.011.0
C3024.018.516.510.517.518.519.520.021.511.515.516.517.5
CF3009.009.000015.516.012.512.50000
NA300000011.515.017.011.50000
CIP3020.512.511.512.511.517.017.018.517.50000
NB3025.018.519.017.519.023.021.020.519.515.514.515.015.5
D3033.025.026.532.025.527.028.027.019.015.515.516.517.0
SD250000000000000
N30000009.5010.59.508.500000
E1515.012.513.014.513.015.016.014.513.09.010.5012.5

*Amoxicillin (AMC30), Tetracycline (TE30), Oxytetracycline (T30), Chloramphenicol (C30), Cephalothin (CF30), Nalidixic acid (NA30), Ciprofloxacin (CIP30), Novobiocin (NB30), Doxycycline (D30), Sulfadiazine (SD25), Neomycin (N30), Erythromycine (E15)

**Antibiotic susceptibility test comparison strains; Listonella anguillarum (KCTC2711).

API Kit을 이용한 생리화학적 특성 분석

항생제 내성, 항산화 활성, 담즙내성, pH 농도별 내산성 실험을 통해 probiotics의 가능성을 가진 후보 균으로 선발되어진 미생물은 G1, G3, G15, G21, B1, B2, B3, B5 8종이며, 각균주에 대한 생리 생화학적 특성 분석한 결과(Table 5) 8종 모두 그람 양성균으로 나타났으며, 성장온도 범위는 10−40℃이며, 염분 농도별 성장 범위는 0−4.5%까지 성장이 확인되었다. G1, G3, G21 균주만 운동성을 가지고 있었다. B2, B5 균주는 구균이며, 나머지 6종은 간균으로 나타났다. Catalase반응에서는 G1, G3, G15, G21 균주에서 양성반응이 나타났으며, oxidase 반응에서는 B1, B2, B3, B5 균주에서 양성 반응이 나타났다.

Table 5 . Analysis of enzyme activity and physiological biochemical characteristics.

CharacteristicsG1G3G15G21B1B2B3B5
Gram reaction+*+++++++
Colony colour (1.5% NaCl TSA medium))BeigeCreamyBeigeBeigeCreamyBeigeCreamyBeige
Temperature range for growth (℃)10-4010-3510-4010-4010-4010-4010-4010-40
NaCl range for growth (%, w/v)0-4.50-4.50-4.50-4.50-4.50-4.50-4.50-4.5
Motility++-*+----
Colony MorphologyRoundIrregularRoundIrregularRoundRoundRoundRound
Cell shapeRodRodRodRodRodCocciRodCocci
Catalase reaction++++----
Oxidase reaction++-+----
Glycerol++-+--w*-
Erythritol--------
D-Arabinose--------
L-Arabinose+++++-+-
D-Ribose++++++++
D-Xylose++++----
L-Xylose--------
D-Adonitol--------
Methyl-βD-Xylopyranoside--------
D-Galactose+--w++++
D-Glucose++++++++
D-Fructose++++++++
D-Mannose++-+++++
L-Sorbose----+---
L-rhamnose----w-w-
Dulcitol--------
Inositolww-w----
D-Mannitol++-++-+-
D-Sorbitol++-++---
Methyl-αD-Mannopyranoside----+-+-
Methyl-αD-Glucopyranoside++-+----
N-Acetylglucosamine++-+++++
Amygdalin++-++++-
Arbutin++-++w+w
Esculin++-+++++
Salicin+w-+++++
D-Cellobiose++-+++++
D-Maltose+w-+++++
D-Lactose-w--+-+-
D-Melibiose--+-+-+-
D-Saccharose++++++++
D-Trehalose++++++++
Inulin--+-+-+-
D-Melezitose----+-+-
D-Raffinose-+--+---
Amidon (Starch)++-+-+-+
Glycogenw+-w----
Xylitol--------
Gentiobiose++-++-+w
D-Turanose+--++-+-
D-Lyxose--------
D-Tagatose+--+w---
D-Fucose--------
L-Fucose--------
D-Arabitol----w-+-
L-Arabitol-------
Gluconate+--++-+-
2-Ketogluconate--------
5-Ketogluconate--------

* +; positive reaction, -; negative reaction, W; weak reaction

선발 미생물의 16S rRNA 염기서열 분석을 통한 계통분석

분리된 균주를 동정하고자 16S rRNA 유전자를 PCR 방법을 이용하여 증폭한 후 그 염기서열을 분석하였고, 결정된염기서열을 바탕으로 blastn 프로그램으로 유사균들의16S rRNA 유전자와의 상동성을 비교한 뒤 계통수를 작성하였다(Fig. 4, Fig. 5). B1은 Lactobacillus paracasei R094 (NR 025880)와 가장 높은 약 99.58%의 상동성을 보였다(Fig. 4, B1). Lactobacillus paracasei는 Collins 등[29]에 의해 처음 발견되었으며, 동물의 장에 서식하면서 유익한 작용을 하는 대표적 미생물로서, 현재 발효유와 생균제 등에 널리 사용되고 있는 probiotic bacteria이다. B2는 Lactococcus lactis NBRC1 00933 (NR 113960)과 가장 높은 약 99.43%의 높은 유사성을 보였다(Fig. 4, B2). L. lactis는 Schleifer [30]에 의해 보고되었으며, 동물체의 위와 질 등에 살고 있으며, 유해균의 증식을 억제하며 에이즈 바이러스(HIV)의 감염을 차단하는데 효과가 있다는 연구결과가 나오기도 하였으며, 식품산업에 있어 치즈와 버터 제조에 사용되는 유산균으로 나이신(Nicin) 생성을 통한 항균 작용을 한다[31, 32]. B3는Lactobacillus plantarum JCM 1149 (NR 115605)과 99.51%의 상동성을 나타냈으며(Fig. 4, B3), L. plantarum는 Orla-Jensen [33]에 의해 발견되고, Bergey 등[34]의 특성을 분석하여 보고하였으며, 요거트·치즈·김치·피클 등 발효식품에 가장 활발히 이용되는 미생물로 상업용은 물론 연구에도 다양하게 활용된다. 또한 산과 담4즙에 의한 파괴가 다른 유산균에 비해 비교적 적어 장 내 독소를 없애는 능력이 매우 뛰어난 것으로 알려져 있다[35]. B5는 Lactococcus lactis subsp. hordniae NBRC 100931 (NR 113958)과 가장 높은 99.36%상동성을 나타냈으며(Fig. 4, B5), Lactococcus lactis subsp. hordniae는 Latorre-Guzman 등[36]에 의해 분류되고, Schleifer 등[30]에 의해 L. lactis의 아종으로 분류되었다. G1는 Bacillus licheniformis DSM 13 (NR 118996)와 가장 높은 99.16% 상동성을 나타냈으며(Fig. 5, G1), B. licheniformis는 Weigmann [37]에 의해 처음 보고되었으며, Chester[38]가계통분류를 하였다. B. licheniformis는 장내 균총을 개선하는데 유용한 미생물로 B. licheniformis는 pH 3, 4, 6, 7에서안정적인 생존율(80%), 고염(10%)에서 최적 생존율(100%),아포를 형성한 B. licheniformis는 고 농도 에탄올 함량(32%)에서의 생존율(90%)이 높다는 연구결과도 보고되었다[39]. G3는 Bacillus velezensis CBMB 205(NR 116240)과 99.44%의높은 상동성을 나타냈으며(Fig. 5, G3), B. velezensis는 Cristina 등[40]에 의해 처음 보고가 된 미생물로 식물 근권및 토양에서 분리가 되었지만 최근 제주도내 해양시료에서Han 등[41]에 의해 내산성 및 호염성 미생물로 분리 보고되었다. G15는 Brevibacterium frigoritolerans DSM 8801 (NR 11774)와 99.51% 상동성을 나타냈으며(Fig. 5, G15), B. frigoritolerans는 Delaporte와 Sasson[42]에 의해 분류되었다. B. frigoritolerans는 해양 유류 분해 활성 및 항진균 활성과 식물 생장 촉진하는 미생물제[43] 기능을 가지고 있다는 연구 결과도 보고되었다. G21는 Bacillus pumilus ATCC 7061 (NR043242)와 가장 높은 99.51% 상동성을 나타냈으며(Fig. 5, G21), B. pumilus는 Meyer와 Gottheil [44]에 의해 발견이 되었으며, 양식어류 병원성 미생물인 Streptococci를 억제하는 효능[45], Vibrio alginolyticus에 대한 항균활성[46]을 가지고 있음이 밝혀졌다. 붉바리 장내에서 분리된 균주들은 16S rRNA gene sequence 분석한 결과를 바탕으로B1 균주는 Lactobacillus paracasei B1, B2는 Lactococcus lactis B2, B3 균주는 Lb. plantarum B3, B5 균주는Lactococcus lactis subsp. hordniae B5, G1은 B. licheniformis G1, G3는 B. velezensis G3, G15는 B. frigoritolerans G15, G21 균주는 B. pumilus G21로 명명하였다.

Figure 4.Neighbor-joining phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequence showing the position of strain B1, B2, B3, B5 within the radiation of the genus Lactobacillus (B1, B3), Lactococcus (B2, B5) and related texa. The tree was constructed from evolutionary distances by using neighbor-joining method and the model of Juke & Cantor. The scale bar indicates 0.01 substitution per nucleotide position. The numbers at the branch nodes are bootstrap values from 1000 bootstrap trails.

Figure 5.Neighbor-joining phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequence showing the position of strain G1, G3, G15, G21 within the radiation of the genus Bacillus (G1, G3, G21), Brevibacterium (G15) and related texa. The tree was constructed from evolutionary distances by using neighbor-joining method and the model of Juke & Cantor. The scale bar indicates 0.01 substitution per nucleotide position. The numbers at the branch nodes are bootstrap values from 1000 bootstrap trails.

요약

Go to

본 연구에서는 제주도 양식장에서 사육되고 있는 붉바리장내에서 균주를 분리·동정하여, 산업적으로 활용할 수 있는프로바이오틱스의 잠재적 가능성을 평가하였다. 붉바리 장내에서 순수 분리된 129균주를 대상으로 1차적으로 자체적인 간이 항균활성 실험을 통해 clear zone이 10 mm 이상 되는 12균주를 선별하여 내담즙성, pH 농도별 내산성, 항산화활성, 항생제 내성, API kti을 이용한 생리생화학적 특성 실험에 이용하였다. 각 특성 실험을 통해 probiotics으로 잠재적 가능성을 가진 균으로 선발되어진 미생물은 G1, G3, G15, G21, B1, B2, B3, B5 총 8종이다. 8종 중 B균주 그룹(B1, B2, B3, B5)은 G균주 그룹(G1, G3, G15, G21)보다 유의하게 높은 활성을 나타내었다. 선발되어진 미생물의 16S rRNA 염기서열 분석을 통한 계통 분석을 한 결과를 바탕으로 B1균주는 L. paracasei B1, B2는 L. lactis B2, B3 균주는 Lb. plantarum B3, B5 균주는 L. lactis subsp. hordniae B5, G1은 B. licheniformis G1, G3는 B. velezensis G3, G15는B. frigoritolerans G15, G21 균주는 B. pumilus G21로 명명하였다.

Acknowledgments

Go to

This research was supported by the 2024 scientific promotion pro-gram funded by Jeju National University.

Conflict of Interest

Go to

The authors have no financial conflicts of interest to declare.

References

Go to
  1. Gilliland S, Morelli L, Reid G. 2001. Health and nutritional properties of probiotics in food including powder milk with live lactic acid bacteria, pp. 3-22. Report of a Joint FAO/WHO Expert Consultation, Cordoba, Argentina.
  2. Park JM, Lee JH, Hong SI. 2014. A research trend analysis of probiotics and prebiotics. Food Sci. Ind. 47: 54-66.
  3. Seo Y, Yoon Y, Kim S. 2019. Functionality and safety of probiotics. J. Dairy Sci. Biotechnol. 37: 94-101.
    CrossRef
  4. Saarela M, Mogensen G, Fonden R, Mättö J, Mattila-Sandholm T. 2000. Probiotic bacteria: safety, functional and technological properties. J. Biotechnol. 84: 197-215.
    Pubmed CrossRef
  5. Gueimonde M, Salminen S. 2006. New methods for selecting and evaluating probiotics. Dig. Liver Dis. 38: S242-S247.
    Pubmed CrossRef
  6. Seong YJ, Park MS. 2019. Trends in probiotics product. Food Sci. Ind. 52: 229-240.
  7. Donatella C, Caterina F. 2016. Importance of prebiotics in aquaculture as immunostimulants. Effects on immune system of Sparus aurata and Dicentrarchus labrax. Fish Shellfish Immunol. 54: 172-178.
    Pubmed CrossRef
  8. Gibson GR, Roberfroid MB. 1995. Dietary modulation of the human colonic microbiota: Introducing the concept of prebiotics. J. Nutr. 125: 1401-1412.
    Pubmed CrossRef
  9. Sekar A, Packyam M, Kim K. 2016. Growth enhancement of shrimp and reduction of shrimp infection by Vibrio parahaemolyticus and white spot syndrome virus with dietary administration of Bacillus sp. Mk22. Microbiol. Biotechnol. Lett. 44: 261-267.
    CrossRef
  10. Ziaei-Nejad S, HabibiRezaei M, Azari Takami G, Lovett D, Mirvaghefi AR, Shakouri M. 2006. The effect of Bacillus sp. bacteria used as probiotics on digestive enzymes activity, survival and growth in the Indian white shrimp Fenneropenaeus indicus. Aquaculture 252: 516-524.
    CrossRef
  11. Jang IS, Kim DH, Heo MS. 2013. Dietary administration of probiotics, Bacillus sp. IS-2, enhance the innate immune response and disease resistance of Paralichthys olivaceus against Streptococcus iniae. Korean J. Microbiol. 49: 172-178.
    CrossRef
  12. Rengpipat S, Rukpratanporn S, Piyatiratitivorakul S, Menasaveta P. 2000. Immunity enhancement in black tiger shrimp (Penaeus monodon) by a probiont bacterium (Bacillus S11). Aquaculture 191: 271-288.
    CrossRef
  13. Mongkolthanaruk W. 2012. Classification of Bacillus beneficial substances related to plants, humans and animals. J. Microbiol. Biotechnol. 22: 1597-1604.
    Pubmed CrossRef
  14. Nagórska K, Bikowski M, Obuchowski M. 2007. Multicellular behaviour and production of a wide variety of toxic substances support usage of Bacillus subtilis as a powerful biocontrol agent. Acta Biochim. Pol. 54: 495-508.
    Pubmed CrossRef
  15. Sugita H. 1998. Production of the antibacterial substance by Bacillus sp. strain NM 12, an intestinal bacterium of Japanese coastal fish. Aquaculture 165: 269-280.
    CrossRef
  16. Sim MU, Han DK. 2023. Assessment of probiotic potential of Bacillus spp. isolated from Ulleungdo, Korea. J. Mar. Life Sci. 8: 50-55.
  17. Walker DK, Gilliland SE. 1993. Relationship among Bile tolerance, Bile salt deconjugation, and assimilation of cholesterol by Lactobacillus acidophilus. J. Dairy Sci. 76: 956-961.
    Pubmed CrossRef
  18. Kawagan S. 1996. Protocol for control of body functional material in food. Kakuen press center, Japan. pp. 8-15.
  19. Eugene F, Gilbert HS. 1983. The pyrogallol assay for superoxide dismutase; absence in glutathione artifact. Anal. Biochem. 137: 50-53.
    Pubmed CrossRef
  20. Marklud S, Markuld G. 1974. Involvement of the superoxide anion radical in the autoxidation of purogallol and a convenient assay for superoxide dismutase. Eur. J. Biochem. 47: 467-474.
    Pubmed CrossRef
  21. Lim YS, Kim JY, Kang HC. 2019. Isolation and identification of lactic acid bacteria with probiotic activities from Kimchi and their fermentation properties in Milk. J. Milk Sci. Biotechnol. 37: 115-128.
    CrossRef
  22. Kim MC, Heo MS. 2005. Identification and cultural characterization of antioxidant producing bacteria isolated from the Jeju coasts. Korean J. Life. Sci. 15: 749-754.
    CrossRef
  23. Kim MC, Kim JS, Kim YB, Harikrishan R, Han YJ, Heo MS. 2009. Identification and antioxidant activity of marine actinomycetes Streptomyces sp. ACT-1. Korean J. Microbiol. 45: 397-403.
  24. Kim HJ, Yeo SH, Cho SC, Bae DW, Yoon JH, Hwang YI, et al. 2002. Isolation and Identification of antioxidant-producing marine bacteria and medium optimization. Korean J. Microbiol. Biotechol. 30: 223-229.
  25. Miquel J, Quintanilha AT, Weber HU. 1989. Handbook of free radicals and antoxidants in biomedicine. CRC press I. pp. 223.
  26. Thrush MA, Mimnaugh EG, Gram TE. 1982. Activation of pharmacologic agents to radical intermediates. Implications for the role of free radicals in drug action and toxicity. Biochem. Pharmacol. 31: 3335-3346.
    Pubmed CrossRef
  27. Mathur S, Singh R. 2005. Antibiotic resistance in food lactic acid bacteria - A review. Int. J. Food Microbiol. 105: 281-295.
    Pubmed CrossRef
  28. Chon JW, Seo KH, Bae DY, Jeong DK, Song KY. 2020. Status and prospect of lactic acid bacteria with antibiotic resistance. J. Dairy Sci. Biotechnol. 38: 70-88.
    CrossRef
  29. Collins MD, Phillips BA, Zanoni P. 1989. Deoxyribonucleic acid homology studies of Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei sp. nov., subsp. paracasei and subsp. tolerans, and Lactobacillus rhamnosus sp. nov., comb. nov. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 39: 105-108.
    CrossRef
  30. Schleifer KH, Kraus J, Dvorak C, Kilpper-Balz R, Collins MD, Fischer W. 1986. Transfer of Streptococcus lactis and related streptococci to the genus Lactococcus gen. nov. Syst. Appl. Microbiol. 6: 183-195.
    CrossRef
  31. Giraffa G. 2014. Overview of the ecology and biodiversity of the LAB. In: Holzapfel WH, Wood BJB. Editors. Lactic acid bacteria biodiversity and taxonomy. Chichester, UK: John Wily & Sons. pp. 45-54.
  32. Álvarez-Cisneros YM, Ponce-Alquicira E. 2018. Antibiotic resistance in lactic acid bacteria. In: Kumar Y, editor. Antimicrobial resistance: a global threat. London: Intech Open. pp. 53-73.
  33. Orla-Jensen S. 1919. The lactic acid bacteria. Host & Son, Copenhagen. pp. 1-118.
  34. Bergey DH, Harrison FC, Breed RS, Hammer BW, Huntoon FM. 1923. Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 1st ed. The Williams and Wilkins Co., Baltimore. pp. 1-442.
  35. Gad GFM, Abdel-Hamid AM, Farag ZSH. 2014. Antibiotic resistance in lactic acid bacteria isolated from some pharmaceutical and dairy products. Braz. J. Microbiol. 45: 25-32.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  36. Latorre-Guzman B, Kado C, Kunkee R. 1977. Lactobacillus hordniae, a New Species from the Leafhopper (Hordnia circellata). Int. J. Syst. Bacteriol. 27: 362-370.
    CrossRef
  37. Weigmann H. 1898. Uber zwei an der Kasereifung beteiligte Bakterien. Zentralbl. Bakteriol. Parasitenkd. Infektionskr. Hyg. Abt. II. 4: 820-834.
  38. Chester FD. 1901. A manual of determinative bacteriology. The Macmillan Co., New York, pp. 1-401.
  39. Kim JW, Jun KD, Kang JS, Ha BJ, Lee JH. 2005. Characterization of Bacillus licheniformis as a Probiotic. Korean J. Biotechnol. Bioeng. 20: 359-362.
  40. Cristina RG, Victoria B, Fernando MC, Inmaculada L, Emilia Q. 2005. Bacillus velezensis sp. nov., a surfactant-producing bacterium isolated from the river Vélez in Málaga, southern Spain. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 55(Pt 1): 191-195.
    Pubmed CrossRef
  41. Han B, Kim MJ, Ryu DJ, Lee KE, Lee BH, Lee EU, et al. 2019. Isolation and characterization of acid-resistanct and halophilic bacteria using cultivation technique in Jeju island. Korean J. Microbiol. 55: 248-257.
  42. Delaporte B, Sasson A. 1967. [Study of bacteria from arid soils of Morocco: Brevibacterium haloterans n. sp. and Brevibacterium frigoritolerans n. sp]. C R Acad. Hebd. Seances Acad. Sci. D 264: 2257-2260.
  43. Jung TK, Kim JH, Song HG. 2012. Antifungal activity and plant growth promotion by Rhizobacteria inhibiting growth of plant pathogenic fungi. Korean J. Microbiol. 48: 16-21.
    CrossRef
  44. Meyer A, Gottheil O. 1901. Botanische beschreibung einiger bodenbakterien. Zentralbl. Bakteriol. Parasitenkd. Infektionskr. Hyg. Abt. II. 7: 680-691.
  45. Lee MY, Kim EH. 2015. Biological Characters of Bacillus pumilus CPB-St inhibiting the growth of fish pathogenic streptococci. J. Fish Pathol. 28: 63-69.
    CrossRef
  46. Park IS, Oh RK, Lee MJ, Moon JY, Kim YO, Nam BH, et al. 2015. Antibacterial activity of bacteria isolated from rocks on the seashore. Korean J. Fish Aquat. Sci. 48: 904-912.
    CrossRef

Article Tools

Starts of Metrics

Share this article on :

Related articles in MBL

Most Searched Keywords ?

What is Most Searched Keywords?

  • It is most registrated keyword in articles at this journal during for 2 years.