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Microbiology and Biotechnology Letters

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Environmental Microbiology (EM)  |  Microbial Ecology and Diversity

Microbiol. Biotechnol. Lett. 2024; 52(4): 372-382

https://doi.org/10.48022/mbl.2408.08015

Received: August 27, 2024; Revised: October 18, 2024; Accepted: November 12, 2024

광합성 미생물의 활성, 성장, 침전에 미치는 Montmorillonite-Cation-Microorganism 복합체의 영향

Effects of Montmorillonite-Cation-Microorganism Complexes on Photosynthetic Activity, Growth, and Precipitation of Chlorella vulgaris and Microcystis aeruginosa

Ji Won Lee, So-Yeon Jeong*, and Tae Gwan Kim*

Department of Microbiology, Pusan National University, Busan 46241, Republic of Korea

Correspondence to :
So-Yeon Jeong,        jeongsy69@gmail.com 
Tae Gwan Kim,         tkim@pusan.ac.kr

Abstract

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Clay flocculation combined with biocontrol agents can effectively and stably control harmful algal blooms (HAB) by aggregating and suppressing them. In this study, we developed various montmorillonite-cation-microbe (MCM) complexes and evaluated their effects on the activity, growth, and precipitation of photo-synthetic microorganisms (Chlorella vulgaris and Microcystis aeruginosa). Tumebacillus sp. FS08 and Bacillus cereus were selected as biocontrol agents against HAB after testing the anti-HAB efficacy of various bacteria on photosynthetic microorganisms. Calcium ion (Ca2+) and manganese ion (Mn2+) were used as bridging cations for montmorillonite (MMT) and biocontrol microbes. Four MCM complexes were developed: MMT-Ca-Bacillus (MCM-CB), MMT-Mn-Bacillus (MCM-MB), MMT-Ca-Tumebacillus (MCM-CT), and MMT-Mn-Tumebacillus (MCM-MT). The recoverable population remained stable over six weeks in MCM-CB, MCM-CT, and MCM-MT, but not in MCM-MB. All MCMs inhibited both the photosynthetic activity and growth of Chlorella during vigorous agitation (p < 0.05). They inhibited the growth of Microcystis under agitation (p < 0.05), but did not inhibit its photosynthetic activity except for MCM-CB. Additionally, all MCMs effectively precipitated the Chlorella and Microcystis cells and inhibited their photosynthetic activity within the resulting precipitates (p < 0.05). Our results indicate that MCMs can simultaneously precipitate HAB cells and inhibit their growth and activity. Thus, this MCM technology can be a promising option for HAB controls.

Keywords: Harmful algal bloom (HAB), biocontrol of HAB, montmorillonite, cation

Graphical Abstract


서론

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태양에너지를 화학에너지로 전환하여 유기물을 생성하는광합성 미생물은 수생태계에서 주요한 1차 생산자(primary producer)이다[1]. 과도한 영양염류(질소, 인)의 유입, 느린유속, 수온 및 일사량 증가는 광합성 미생물이 대량 증식하는 harmful algal bloom (HAB) 현상을 야기하며[1], 세계적으로 기후변화, 인간활동 등이 증가함에 따라 HAB의 발생빈도와 정도가 크게 증가하고 있다[2, 3]. HAB는 수계의 산소 소모, 독소 생산 등을 통해 수질을 오염시키고 담수 및 해양 환경의 수생태계 불균형을 초래한다[4]. 또한, 환경적, 심미적 관점 등에서 인간에게 직·간접적 악영향을 미치기 때문에 HAB를 효과적으로 관리하는 것은 환경적, 공중 보건적,경제적 측면에서 매우 중요하다[4, 5].

HAB를 제거하기 위해 미생물을 응집하고 침전시키는 화학적 응집제가 널리 활용되고 있다[6, 7]. 다양한 응집제 중clay mineral은 천연물질로써 환경에 무해하고 상대적으로낮은 비용과 사용이 편리하다는 이점을 가진다[8]. 다양한 국가(한국, 일본, 중국, 미국 등)에서 HAB 제어를 위해 clay mineral을 사용하여 효과적으로 HAB 미생물을 제거한 결과가 보고되었다[6]. Clay mineral이 HAB 미생물의 응집과침전에 미치는 효율은 이들의 종류, 입자 사이즈 및 형태에따라 달라질 수 있으며, 다양한 방법(산처리, 이온 치환 등)에 의한 clay 표면 개질(modification)을 통해 HAB 제거 효율을 향상시킬 수 있다[7, 9, 10]. Clay mineral 종류에는 몬모릴로나이트(montmorillonite, MMT), 벤토나이트(bentonite),카올리나이트(kaolinite), 일라이트(illite) 등이 있으며, 이들은 각각 다른 화학적 구성과 구조를 가지고 물리적 및 화학적 특성에 차이를 나타낸다[11]. 그 중에서 MMT는 높은 양이온 교환성과 흡착력, 팽윤성을 나타낼 뿐만 아니라 미생물고정화 담체(carrier)로써 미생물의 생존과 활성을 장기간 안정적으로 유지할 수 있는 가능성이 있다[12, 13].

HAB 제어를 위한 생물학적 방법으로써 수생태계에서 높은 풍부도와 다양성을 가진 세균을 활용할 수 있으며 이들은 광합성 미생물과 긴밀하게 연결되어 상호작용을 한다[14, 15]. 일부 세균은 살조 물질(algicidal metabolites)을생성하거나 직접적인 물리적 공격을 통해 광합성 미생물의성장을 억제한다[15, 16]. 다양한 메커니즘을 통해 살조 활성(algicidal activity)을 나타내는 세균으로 Bacillus, Pseudomonas, Lactobacillus, Acinetobacter, Streptomyces등이 보고되었으며, 이들은 HAB 제어를 위한 생물학적제제(biocontrol agent)가 될 수 있다[16−18]. 예를 들어, 강에서 분리한 Bacillus sp. Lzh-5에 의해 생성된 살조 물질은Microcystis aeruginosa에 대해 강한 살조 활성을 나타내었으며, 그의 형태학적 변화를 유발했다고 보고되었다[19]. 또한, Pseudomonas aeruginosa PA14는 M. aeruginosa의 성장을 억제할 뿐만 아니라 M. aeruginosa가 생성하는 독소의한 종류인 microcystin을 제거할 수 있다고 보고된 바 있다[20]. HAB 제어를 위한 생물학적제제의 활용은 2차 환경 오염에 대한 영향을 최소화할 수 있으며, 광합성 미생물의 성장을 억제하고 이들의 대량 증식을 예방할 수 있는 지속 가능한 방법이 될 수 있다.

화학적, 물리적, 생물학적인 다양한 HAB 제어 방법들을결합하면 HAB를 보다 효과적으로 해결할 수 있을 것이다. Clay와 생물학적제제의 결합을 통해 HAB 제어 기술을 개발한다면 친환경적이며 기술의 안정성과 효율성을 증가시킬수 있을 것이라 추측된다. 본 연구에서는 MMT와 생물학적제제로써 광합성 활성 및 성장을 억제하는 세균, 그리고 이들을 연결하기 위한 양이온을 사용해서 montmorillonite-cation-microbes (MCM) 복합체를 개발하였다. 두 종류의 세균(Bacillus cereus, Tumebacillus sp. FS08)과 양이온(칼슘,망간)을 사용해서 네 종류의 MCM 복합체를 제조하였으며,이들이 광합성 미생물(Chlorella vulgaris, M. aeruginosa)의활성, 성장, 침전에 미치는 영향을 규명하였다. 또한, MCM에서 희석평판배양법을 통해 미생물 보존성을 평가하였다.

재료 및 방법

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사용 균주 및 배양 조건

본 연구에서는 광합성 미생물 2종(Chlorella vulgaris, Microcystis aeruginosa)과 세균 14종을 사용하였다(Table 1). C. vulgaris는 담수 환경에 흔히 존재하는 녹조류로써 광합성 효율이 우수하고 성장 속도가 빨라 대량 증식이 가능하다[21]. M. aeruginosa는 HAB를 일으키는 대표적인 종으로써 독소의 종류인 microcystin을 생성하기 때문에 다양한 측면에서 많은 주목을 받고 있다[22]. 세균은 이전 연구 결과를 바탕으로 광합성 미생물의 활성을 억제하는 종을 선택하였으며[23], spore를 형성하며 살조 물질을 분비한다고 알려진 Bacillus 속 3종을 포함시켰다[18]. 광합성 미생물 2종과 Bacillus 속, Lactobacillus는 낙동강생물자원관 담수생물자원은행(https://fbp.nnibr.re.kr/fbcc)에서 분양 받았으며, 다른 세균은 다양한 환경으로부터 분리하였다[23, 24].

Table 1 . Microbial isolates used in this study.

No.IsolatesPhylumClassCulture collection
1Chlorella vulgarisE PChlorophytaTrebouxiophyceaeFBCC 180003
2Microcystis aeruginosaB PCyanobacteriaCyanophyceaeFBCC-A59
3Arthrobacter sp. MF02BActinomycetotaActinomycetiaKCTC 49587
4Bacillus albusBBacillotaBacilliFBCC-B50
5Bacillus cereusBBacillotaBacilliFBCC-B807
6Bacillus pumilusBBacillotaBacilliFBCC-B4056
7Burkholderia sp. FS12BPseudomonadotaBetaproteobacteriaKCTC 82584
8Fictibacillus sp. MF07BBacillotaBacilliKCTC 43355
9Lactobacillus plantarumBBacillotaBacilliFBCC-B367
10Micrococcus sp. MF01BActinomycetotaActinomycetiaKCTC 49590
11Mucilaginibacter sp. FS06BBacteroidotaSphingobacteriiaKCTC 82589
12Mycobacterium sp. MF03BActinomycetotaActinomycetiaKCTC 49594
13Paraburkholderia sp. FS13BPseudomonadotaBetaproteobacteriaKCTC 82583
14Pedobacter sp. FS05BBacteroidotaSphingobacteriiaKCTC 82590
15Sphingopyxis sp. NM1BPseudomonadotaAlphaproteobacteriaKCTC 32429
16Tumebacillus sp. FS08BBacillotaBacilliKCTC 43304

E Eukarya; B Bacteria; and P photosynthetic.

FBCC, Freshwater Bioresources Culture Collection, Korea

KCTC, Korean Collection for Type Cultures, Korea

광합성 미생물의 배양은 BG11 배지(MB cell, KisanBio Co., Ltd., Republic of Korea)를 사용했으며 530 ml의 혈청병(serum bottle)에 100 ml의 배지와 1 ml의 배양액을 분주한 후 혈청병 입구를 고무마개로 밀봉하고 CO2 가스를 최종농도 5%가 되도록 주입하였다. 광합성 미생물은 조도 3,000 lux (24L:0D), 온도 25℃, 200 rpm 조건에서 배양하였다. 세균은 실험 전까지 1 g·l-1의 R2A 고체배지(MB cell)에서 순수 콜로니 상태로 유지하였다. 세균 배양액을 획득하기 위해콜로니를 R2A 액체배지에 접종한 후 30℃, 200 rpm에서 균에 따라 24시간에서 최대 48시간 동안 배양하였다. 본 연구에서 모든 실험에 사용한 균 배양액은 위와 같은 방법으로준비하였다.

광합성 미생물의 활성 및 성장에 미치는 세균의 영향

광합성 미생물의 광합성 활성에 미치는 세균의 영향은 광독립영양 조건에서 CO2 농도 측정을 통해 분석하였다. 광합성 미생물과 세균 배양액은 상기의 방법으로 준비한 후 각각 680 nm와 600 nm 파장에서 UV-1800 spectrophotometer (Shimadzu Corp., Kyoto, Japan)를 이용해서 흡광도를 측정하였으며, 최종 OD 값이 0.4가 되도록 BG11 배지로 희석하였다. 광합성 미생물과 세균 배양액을 각 10 ml씩 1:1 비율로 혼합하여 110 ml 혈청병에 총 20 ml을 분주한 후 병 입구를 고무마개로 밀봉하고, CO2 가스를 5% 농도로 주입하였다. 배양액은 광합성 미생물의 배양 조건과 동일하게 하여24시간 동안 배양하면서 혈청병 내 CO2 농도를 측정하였다. 대조군은 세균 배양액 대신 동일 부피로 BG11 배지를 채워주었다.

광합성 미생물의 성장에 미치는 세균의 영향은 종속영양조건에서 세포 계수를 통해 분석하였다. 위와 동일하게 준비한 광합성 미생물과 세균 배양액을 혼합하여 14 ml test tube에 1 ml을 분주하고 R2A 액체배지 9 ml을 채워준 후, 30℃, 200 rpm에서 24시간 동안 배양하였다. Hemocytometer (Paul Marienfeld GmbH & Co. KG, Germany)를 이용해서광학 현미경(Axio observer 3, Carl Zeiss Co., Ltd., Germany)을 통해 광합성 미생물의 세포를 직접 계수하였다.

광합성 미생물의 활성 및 침전에 미치는 MMT의 영향

MMT (Kanben Mining Co., Ltd., Japan)는 울산시 소재한국아쿠아서비스에서 제공 받았으며, 평균 입자 크기는20.8 ± 0.2 µm, pH는 9.5 ± 0.2, 수분 함량은 6.7 ± 0.1%, 전기전도도(EC)는 10.3 ± 0.0 dS·m-1로 측정되었다. MMT는121℃에서 20분 동안 멸균 후 상온에 보관하면서 실험에 사용하였다. Chlorella와 Microcystis 배양액의 초기 농도는BG11 배지를 사용해서 OD 값 0.4가 되도록 희석하였다.

광합성 미생물의 활성에 미치는 MMT의 영향을 알아보기위해 110 ml 혈청병에 배양액 20 ml을 분주한 후 농도별(1, 2 g·l-1)로 MMT를 넣어주었다. 혈청병 입구를 고무마개로 밀봉한 후 CO2 가스를 최종 농도 5%가 되도록 주입하였다. 배양액은 광합성 미생물의 배양 조건과 동일하게 하여24시간 동안 배양하면서 혈청병 내 CO2 농도를 측정하였다.

광합성 미생물의 침전에 미치는 MMT의 영향을 알아보기위해 시험관(높이 18 cm, 용량 30 ml)에 배양액 15 ml을 분주한 후 농도별(1, 2 g·l-1)로 MMT를 넣어주었다. 시험관 입구를 고무마개로 밀봉한 후 CO2 가스를 최종 농도 5%가 되도록 주입하였다. 배양액은 조도 3,000 lux (24L:0D), 25℃, 50 rpm 조건에서 13시간 동안 배양하면서 시험관 내 CO2 농도를 측정하였다.

MCM의 제조 및 미생물 보존성 평가

Montmorillonite-cation-microbe (MCM) 복합체를 제조하기 위해 MMT, 양이온(칼슘, 망간), 균액(Bacillus cereus, Tumebacillus sp. FS08)을 사용하였다. 칼슘(Ca2+)과 망간(Mn2+) 이온을 위해 각각 CaCl2와 MnCl2 시약을 사용하여농도 0.25 M의 용액을 제조하였다. Bacillus와 Tumebacillus의 배양액은 상기 세균의 배양 방법과 동일하게 준비하였다.배양액을 회수하여 원심 분리 후 상등액을 제거하고 0.9%NaCl 용액을 이용하여 현탁하였다. 현탁액으로부터 건조균체량(dry cell weight)을 측정하였으며, 각 균액의 바이오매스는 동일하게 5 g·l-1의 농도로 맞추어 주었다. MMT(10 g),양이온(9 ml), 균액(1 ml)을 잘 혼합하고 48시간 동안 상온에서 건조시킨 후 막자 사발을 이용해서 분말화 하였다. 양이온과 세균 각각 두 종을 활용하여 MCM-CB (MMT-Ca-Bacillus), MCM-MB (MMT-Mn-Bacillus), MCM-CT (MMT-Ca-Tumebacillus), MCM-MT (MMT-Mn-Tumebacillus) 네 종류의 MCM 복합체를 제조하였다. MCM은 상온에서 보관하였으며 일주일 간격으로 총 6주 동안 MCM에서 미생물보존성을 평가하였다. 살아있는 미생물의 측정을 위해 희석평판배양법을 통해 30℃에서 48시간 배양 후 집락수를 계산하였다.

광합성 미생물의 활성 및 성장에 미치는 MCM의 영향

Chlorella와 Microcystis 배양액은 상기와 같이 준비한 후BG11 배지를 사용해서 OD 값 0.4가 되도록 희석하였다. 광합성 미생물의 활성에 미치는 MCM의 영향을 알아보기 위해 110 ml 혈청병에 배양액 20 ml을 분주한 후 1 g·l-1로MCM을 넣어주었다. 혈청병 입구를 고무마개로 밀봉한 후CO2 가스를 최종 농도 5%가 되도록 주입하였다. 배양액은광합성 미생물의 배양 조건과 동일하게 하여 48시간 동안 배양하면서 혈청병 내 CO2 농도를 측정하였다. 배양 시작 후24시간 경과 시에 혈청병의 고무마개를 열어 공기를 치환하고 5% 농도로 CO2 가스를 추가 주입해 주었다.

광합성 미생물의 성장에 미치는 MCM의 영향을 알아보기위해 Chlorella와 Microcystis 배양액은 상기와 같이 준비한후 BG11 배지를 사용해서 OD 값 0.1이 되도록 희석하였다. 희석시킨 배양액은 14 ml test tube에 10 ml씩 분주한 후1g·l-1로 MCM을 넣어주었다. 이들의 배양 조건은 광합성 미생물의 배양 조건과 동일하게 하여 48시간 동안 배양하였으며, CO2 가스는 직접 주입하지 않고 대기 중 이산화탄소로대신하였다. Hemocytometer (Paul Marienfeld GmbH & Co. KG)를 이용하여 광학 현미경(Axio observer 3)을 통해배양액에서 광합성 미생물의 세포를 계수하였다.

광합성 미생물의 침전에 미치는 MCM의 영향

Chlorella와 Microcystis 배양액은 상기와 같이 준비한 후BG11 배지를 사용해서 OD 값 0.4가 되도록 희석하였다. 광합성 미생물의 침전에 미치는 MCM의 영향을 알아보기 위해 시험관(높이 18 cm, 용량 30 ml)에 배양액 20 ml을 분주한 후 1 g·l-1로 MCM을 넣어주었다. 배양액은 조도 3,000 lux (24L:0D), 25℃, 50 rpm 조건에서 배양하였으며, 7시간 경과후 상등액으로부터 광합성 미생물의 세포를 계수하였다. MCM에 의한 침전물에서의 광합성 활성을 분석하기 위해 시험관 바닥에서 부피 1ml을 남기고 상등액을 제거하였다. 시험관 입구를 고무마개로 밀봉한 후 CO2 가스를 최종 농도5%가 되도록 주입하였다. 침전물은 광합성 미생물의 배양조건과 동일하게 하여 48시간 동안 배양하면서 CO2 농도를측정하였다. 배양 시작 후 24시간 경과 시에 시험관 입구의고무마개를 열어 공기를 치환하고 5% 농도로 CO2 가스를추가 주입해 주었다.

광합성 미생물의 활성 분석을 위한 CO2 농도 분석

CO2 농도는 열전도성 검출기(thermal conductivity detector)와 Rt-Q-BOND (30 m × 0.53 mm × 20 µm, Restek, USA) 컬럼이 장착된 가스크로마토그래피(GC-2010 plus, Shimadzu Corp., Japan)를 이용하여 측정하였다. 분석 조건은 오븐, 시료 주입부, 검출기 온도를 각각 50℃, 100℃, 150℃로 설정하였으며, 이동상 가스로 헬륨(유량 3 ml·min-1, 25 kPa 압력)을 사용하였다. 유리주사기(gas-tight syringe)를 이용하여 혈청병 상부 가스를 0.3 ml 채취하여 초기 CO2 주입 농도와 혈청병 내 잔류 농도를 측정하였다. CO2 동화(assimilation)는 (Ct=0−Ct)/△t(C는 혈청병 내 상부 CO2 mole 수) 수식으로 계산하였다. 본 연구에서 모든 실험은 2반복으로 수행하였다.

결과

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광합성 미생물의 활성 및 성장에 미치는 세균의 영향

광합성 미생물 Chlorella와 Microcystis의 광합성 활성에미치는 세균의 영향을 규명하였다(Fig. 1). 총 14종의 세균은 모두 광합성 미생물의 활성을 억제하였다(p <0.05). Chlorella의 광합성 활성은 Pedobacter(대조군 대비 공배양에서의 CO2 동화 비율, 0.36), Mycobacterium (0.41), Tumebacillus (0.47), B. cereus (0.60)에 의해 가장 크게 억제되었으며, Microcystis의 광합성 활성은 Tumebacillus (0.23), Pedobacter (0.28), Mycobacterium (0.35), Lactobacillus (0.43)에 의해 가장 크게 억제되었다.

Figure 1.Effects of biocontrol bacteria on photosynthetic activity of Chlorella vulgaris (A) and Microcystis aeruginosa (B). As a control, C. vulgaris or M. aeruginosa was not mixed with bacteria, and their photosynthetic activity (CO2 assimilation) was set to a value of 1.

광합성 미생물의 성장에 미치는 세균의 영향을 종속영양조건에서 분석하였다(Fig. 2). Chlorella는 단독으로 배양한경우 24시간 동안 세포수가 초기 대비 평균 2.6배 증가한 반면에 14종의 세균과의 공배양에서 Chlorella의 세포수는 평균 1.0배 증가하였다. 초기 대비 Chlorella의 세포수를 감소시킨 세균은 7종으로 Tumebacillus (초기 대비 공배양에서의 세포수 비율, 0.46), Paraburkholderia (0.74), Pedobacter (0.81), Lactobacillus (0.85) 순으로 Chlorella의 성장을 억제하였다. Microcystis는 단독으로 배양한 경우 24시간 동안 세포수가 초기 대비 평균 2.6배 증가한 반면에 14종의 세균과의 공배양에서 Microcystis의 세포수는 모두 감소하였다(p < 0.05). 세균 14종은 모두 Microcystis의 성장을 억제하였으며, 그 중에서 Tumebacillus (0.27), Burkholderia (0.35), Pedobacter (0.43), B. albus (0.47) 순으로 가장 크게 영향을미쳤다.

Figure 2.Effects of biocontrol bacteria on heterotrophic growth of Chlorella vulgaris (A) and Microcystis aeruginosa (B).

광합성 미생물의 활성 및 침전에 미치는 MMT의 영향

MMT가 광합성 미생물의 활성 및 침전에 미치는 영향을 분석하였다(Fig. 3). MMT는 강한 교반 조건(200 rpm)에서농도에 상관없이 Chlorella와 Microcystis의 광합성 활성을억제하지 않았다(p > 0.05). 하지만 약한 교반 조건(50 rpm)에서 Chlorella와 Microcystis는 MMT에 의해 침전하였으며, 광합성 활성이 억제되었다(p < 0.05). Chlorella는 MMT농도에 따라 광합성 활성에 차이를 보이지 않았지만, Microcystis는 MMT 농도가 1 g·l-1에서 2 g·l-1로 증가함에따라 광합성 활성 억제가 증가하였다(p < 0.05).

Figure 3.Effects of montmorillonite (MMT) on photosynthetic activity of Chlorella vulgaris and Microcystis aeruginosa. MMT effects on C. vulgaris (A) and M. aeruginosa (B) were assessed under vigorous agitation (200 rpm) to prevent cell precipitation. MMT effects on C. vulgaris (C) and M. aeruginosa (D) were assessed under gentle agitation (50 rpm) to allow cell precipitation.

MCM에서 미생물 보존성 평가

MCM 복합체에서 미생물 보존성을 평가하기 위해 MCM 제조 후 6주 동안 MCM으로부터 집락수를 관찰하였다(Fig. 4). Bacillus를 생물학적제제로 사용한 MCM-CB에서는 4주동안 미생물이 안정적으로 유지되었으며 6주차에 초기 대비약 37% 감소하였다. 또한, MCM-MB에서 집락수는 1주차에초기 대비 약 70% 감소한 후 시간에 따라 지속적으로 감소하였다. 하지만 Tumebacillus를 생물학적제제로 사용한MCM-CT와 MCM-MT에서는 6주 동안 집락수가 안정적으로 유지되었다.

Figure 4.Survival of biocontrol agents in montmorillonite (MMT)-cation-microbe (MCM) complexes. MMT-Ca-Bacillus, MCM-CB; MMT-Mn-Bacillus, MCM-MB; MMT-Ca-Tumebacillus, MCM-CT; and MMT-Mn-Tumebacillus, MCM-MT.

광합성 미생물의 활성 및 성장에 미치는 MCM의 영향

MCM 복합체가 광합성 미생물의 활성 및 성장에 미치는 영향을 강한 교반 조건(200 rpm)에서 분석하였다(Fig. 5). 모든 MCM은 Chlorella의 광합성 활성을 억제하였으며(p < 0.05), MCM 종류에 따른 효능의 차이는 없었다(p > 0.05). MCM을 넣어준 조건에서 Chlorella의 광합성 활성은 대조군 대비 평균 11% 감소하였다. Microcystis의 광합성 활성은MCM-CB에 의해서만 억제되었으며, MCM-MB, MCM-CT, MCM-MT는 광합성 활성을 억제하지 않았다. MCM-CB를 넣어준 조건에서 Microcystis의 광합성 활성은 대조군 대비16% 감소하였다.

Figure 5.Effects of different montmorillonite (MMT)-cation-microbe (MCM) complexes on Chlorella vulgaris and Microcystis aeruginosa under vigorous agitation (200 rpm). Photosynthetic activity of C. vulgaris (A) and M. aeruginosa (B); and population growth of C. vulgaris (C) and M. aeruginosa (D). MMT-Ca-Bacillus, MCM-CB; MMT-Mn-Bacillus, MCM-MB; MMT-Ca-Tumebacillus, MCM-CT; and MMT-Mn-Tumebacillus, MCM-MT.

모든 MCM은 Chlorella의 성장을 억제하였으며(p <0.05), MCM 종류에 따른 효능의 차이는 없었다(p > 0.05). Chlorella를 단독으로 배양한 경우 48시간 동안 초기 대비 세포수가약 4.2배 증가한 반면에 MCM을 넣어준 조건에서 세포수는평균 2.0배 증가하였다. 모든 MCM은 Microcystis의 성장을억제하였으며(p < 0.05), MCM 종류에 따른 효능의 차이는없었다(p > 0.05). Microcystis를 단독으로 배양한 경우 48시간 동안 초기 대비 세포수가 약 3.4배 증가한 반면에 MCM을 넣어준 조건에서 세포수는 평균 1.5배 증가하였다.

광합성 미생물의 침전에 미치는 MCM의 영향

MCM 복합체가 광합성 미생물의 침전에 미치는 영향 및침전물에서의 광합성 활성을 분석하였다(Fig. 6). 약한 교반 조건(50 rpm)에서 Chlorella와 Microcystis는 모든 MCM에 의해 침전되었다. 각 배양액의 상등액에서 Chlorella의 세포수는 대조군 대비 평균 44%, Microcystis는 평균 79% 감소하였다. 모든 종류의 침전물에서 광합성 활성이 억제되었으며(p < 0.05), MCM 종류에 따른 효능의 차이는 없었다(p > 0.05). 침전물에서 Chlorella의 광합성 활성은 대조군 대비평균 25%, Microcystis는 평균 34% 감소하였다.

Figure 6.Precipitation and inhibition of Chlorella vulgaris and Microcystis aeruginosa by montmorillonite (MMT)-cation-microbe (MCM) complexes. Remaining population of C. vulgaris (A) and M. aeruginosa (B) in the water body and photosynthetic activity of C. vulgaris (C) and M. aeruginosa (D) within the resulting precipitates. MMT-Ca-Bacillus, MCM-CB; MMT-Mn-Bacillus, MCM-MB; MMTCa-Tumebacillus, MCM-CT; and MMT-Mn-Tumebacillus, MCM-MT.

고찰

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본 연구에서는 clay mineral과 광합성 미생물의 활성을 억제하는 세균, 이들을 연결하는 양이온을 사용해서 montmorillonite-cation-microbes (MCM) 복합체를 제조하였다. 미생물의 응집과 침전을 가능하게 하는 clay mineral은 미생물의 생존과 활성을 장기간 유지할 수 있는 서식처가 될 수 있다[12]. 그러므로 clay mineral 기반 복합체는 생물학적제제의 저장 수명을 증가시켜 이의 보관 및 관리에 효과적이다. 또한, 복합체는 harmful algal bloom (HAB) 환경에서 장기간 활성을 유지하여 생물학적제제의 단독 사용에비해 효율성과 안정성을 크게 향상시킬 수 있다. MCM 복합체가 광합성 미생물의 활성, 성장, 침전에 미치는 영향을 평가함으로써 HAB 제어를 위한 MCM의 효율성과 안정성을제시하고자 하였다. MCM 제조에 사용할 균을 선택하기 위해 기존 연구 결과를 바탕으로 광합성 활성을 억제하는 세균(10종), spore를 형성하며 살조 활성이 보고된 Bacillus (3종), 유익균으로 알려진 Lactobacillus (1종) 총 14종을 인위적으로 선별하여, 이들이 광합성 미생물의 활성과 성장에미치는 영향을 분석하였다(Fig. 1, Fig. 2). 모든 14종의 세균은 광합성 미생물(Chlorella, Microcystis)의 활성을 억제하였으며, 순서에는 차이가 있었지만 Pedobacter, Mychobacterium, Tumebacillus는 이들의 광합성 활성을 가장 강하게 억제하였다. 또한, Tumebacillus와 Pedobacter는 Chlorella와 Microcystis의 성장도 강하게 억제함으로써, 광합성 미생물의 활성과 성장 모두를 억제하는데 가장 효과적이었다. Tumebacillus의 살조 활성은 다른 연구에서 보고된 바가 없으며 우리의 이전 연구 결과에서 Chlorella sp. MF1907의광합성 활성을 강하게 억제하였다[23]. 본 연구 결과를 통해 Tumebacillus의 살조 활성에 대한 가능성을 제시하였으며,구체적인 기작에 대해서는 추후 연구가 필요하다. 또한, Pedobacter의 살조 활성은 Microcystis에 대해서 보고된 바 있지만 명확한 기작에 대해서는 거의 알려진 바가 없다[25]. Pedobacter sp. MaI11-5는 Microcystis의 성장을 억제하였으며, Microcystis는 자기 방어를 위해 세포 외 물질을 분비한다고 보고되었다[25, 26]. 본 연구에서는 montmorillonite-cation-microbes(MCM) 복합체 개발을 위해 광합성 미생물의 활성 및 성장에서 가장 우수한 억제 효능을 나타낸 Tumebacillus와 다양한 연구에서 살조 활성이 보고된Bacillus cereus를 선택하였다[18, 19]. Bacillus는 살조 물질을 생성할 수 있고[18], spore를 형성하여 외부 환경으로부터 높은 안정성을 나타내기 때문에 HAB 제어를 위한 우수한 생물학적제제가 될 수 있다[27]. 본 연구 결과에서 Tumebacillus와 더불어 Bacillus는 Chlorella와 Microcystis의 광합성 활성과 성장을 효과적으로 억제하였다.

Montmorillonite (MMT)는 강한 교반 조건(200 rpm)에서광합성 미생물의 활성에 영향을 미치지 않았다(p > 0.05)(Fig. 3). 본 연구에서 사용한 세균의 일부 종(Pedobacter, Mycobacterium, Sphingopyxis, Paraburkholderia, Burkholderia)에 대해서도 동일한 조건에서 MMT의 영향을 평가한 결과,이들의 활성에 영향을 미치지 않았다(data not shown). MMT는 미생물 활성에 부정적인 영향을 미치지 않으며 물리적인 역할을 통해 HAB를 제거할 수 있음을 나타낸다. Clay mineral은 자연적으로 발생하는 물질로써 친환경적이고 독성이 없다고 알려져 있으며[8], 미생물 고정화를 위한우수한 담체 역할이 가능할 것이다. MMT는 Chlorella와 Microcystis의 응집과 침전에 효과적이었으며, Microcystis는MMT의 농도 증가에 따라 침전 효과가 증가하였다. HAB 미생물의 응집과 침전에 가장 효과적인 clay mineral의 적정농도가 존재하며[6, 28], 실제 적용을 위해서 환경적, 경제적측면이 모두 고려되어야 할 것이다.

MMT와 세균, 양이온을 사용해서 네 종류의 MCM 복합체(MCM-CB, MCM-MB, MCM-CT, MCM-MT)를 제조하였다. MCM 복합체에서 미생물의 보존성을 평가하기 위해 희석 평판배양법을 통해 집락수를 계산하였다(Fig. 4). Bacillus를 이용한 MCM-MB는 1주 후에 집락수가 초기 대비 약 70%감소하였으며, MCM-CB는 4주 동안 미생물이 안정적으로유지되다가 6주 후에 초기 대비 약 37% 감소하였다. Tumebacillus를 이용한 MCM-CT와 MCM-MT는 6주 동안미생물이 안정적으로 보존되었다. 따라서 MCM-MB를 제외하고 다른 3종의 MCM은 다른 실험 과정에서도 미생물 수가 유사했을 것이라고 판단된다. 본 연구 결과에 따라 MCM에서 Tumebacillus가 Bacillus 보다 보존성이 더 높다고 판단되며, Tumebacillus는 MCM 기술을 위한 생물학적제제로써 효능과 안정성 모두를 충족하였다. 추가적으로, MMT의농도 및 MCM의 보관 온도는 미생물 보존성에 영향을 미칠수 있으며, 추후 연구를 통해 미생물을 장기간 보존하기 위한 최적 조건 도출이 가능할 것이다.

강한 교반 조건(200 rpm)에서 모든 MCM은 Chlorella의광합성 활성과 성장을 모두 억제하였다(p < 0.05) (Fig. 5). 또한, 모든 MCM은 Microcystis의 성장을 억제하였지만(p < 0.05), Microcystis의 광합성 활성은 MCM-CB에 의해서만 억제되었다. MCM-MB, MCM-CT, MCM-MT가 Microcystis의성장과 활성에 미치는 저해 효과의 불일치는 우리의 연구 결과에서 명확하게 설명할 수 없지만 다양한 가능성을 추측하여 추후 연구를 통해 규명할 것이다. 강한 교반 조건에서 MMT를 단독으로 적용한 경우 MCM 결과와 유사한 수준으로 Chlorella와 Microcystis의 성장이 억제되었다(p < 0.05)(data not shown). 하지만 강한 교반 조건에서 MMT가 광합성 미생물의 활성에 영향을 미치지 않는 것으로 보아(Fig. 3), MCM에서 MMT와 생물학적제제는 각각 광합성 미생물의 성장과 활성에 더 크게 영향을 미쳤다고 추측된다. 약한 교반 조건(50 rpm)에서 모든 MCM에 의해 Chlorella와 Microcystis가 효과적으로 침전하였으며, MCM은 Chlorella (상등액에서의 세포 제거율, 44%)보다 Microcystis (79%)의세포 침전에 더욱 효과적이었다(Fig. 6). Clay mineral에 의한 HAB 응집 및 제거 효율은 미생물의 종류, 농도 등에 따라 달라질 수 있다고 보고된 바 있다[6, 28]. MCM은 Chlorella와 Microcystis의 광합성 활성과 성장을 억제할 수있으며, 이들의 세포 침전에도 효과적이지만 MCM 종류에따른 효능의 차이는 보이지 않았다(p > 0.05). MMT는 물리적으로 광합성 미생물의 응집과 침전에 영향을 미치며, 세균은 직접적으로 광합성 미생물의 성장과 활성을 억제하기 때문에 MCM 기술은 종류에 상관없이 안정적으로 HAB를 제어할 수 있다고 판단된다. 본 연구에서 제조한 MCM은 광합성 미생물의 활성 및 성장을 억제하고 세포를 효과적으로 침전시켜 HAB 제어를 위한 효율적인 기술이 될 수 있을 것이다. 또한, 다양한 종류의 clay mineral과 양이온, 생물학적제제를 조합하여 MCM 기술을 최적화한다면 더욱 안정적으로HAB 제어가 가능할 것이다.

요약

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광합성 미생물을 응집하는 clay와 이들의 활성과 성장을억제하는 세균의 결합은 harmful algal blooms (HAB)을 효과적이고 안정적으로 제어할 수 있다. 본 연구에서는 HAB제어를 위해 clay mineral인 montmorillonite (MMT)와 세균, 이들을 연결하는 양이온을 사용해서 montmorillonite-cation-microbes (MCM) 복합체를 제조하고, MCM이 광합성미생물(Chlorella vulgaris, Microcystis aeruginosa)의 활성, 성장, 침전에 미치는 영향을 평가하였다. 광합성 미생물에 대한 다양한 세균의 항 HAB 효능을 바탕으로 Tumebacillus sp. FS08과 Bacillus cereus를 생물학적제제(biocontrol agent)로 선택하였다. MMT와 세균을 연결하는 양이온으로써 칼슘 이온(Ca2+)과 망간 이온(Mn2+)을 사용하였다. 각 두종의 생물학적제제와 양이온을 사용하여 다음과 같은 네 종류의 MCM 복합체를 제조하였다: MMT-Ca-Bacillus (MCM-CB), MMT-Mn-Bacillus (MCM-MB), MMT-Ca-Tumebacillus (MCM-CT), MMT-Mn-Tumebacillus (MCM-MT). MCM으로부터 희석평판배양법을 통해 집락수를 관찰한 결과, MCM-MB를 제외한 MCM-CB, MCM-CT, MCM-MT에서 미생물은 최대 6주 동안 안정적으로 유지되었다. 모든 MCM은 강한 교반 조건(200 rpm)에서 Chlorella의 광합성 활성 및 성장을 억제하였다(p < 0.05). 또한, 모든 MCM은 강한 교반 조건에서 Microcystis의 성장을 억제한 반면에MCM-CB를 제외하고 나머지는 Microcystis의 광합성 활성을 억제하지 않았다. 모든 MCM에 의해 Chlorella와 Microcystis가 효과적으로 침전하였으며, 그 결과 침전물에서도 광합성 활성이 억제되었다(p < 0.05). 본 연구 결과는MCM이 광합성 미생물의 침전과 동시에 그들의 활성 및 성장을 억제할 수 있음을 나타낸다. 따라서, MCM은 HAB 제어를 위한 유망한 선택적 기술이 될 수 있음을 시사한다.

Acknowledgments

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This work was supported by a 2-Year Research Grant of Pusan National University.

Conflict of Interest

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The authors have no financial conflicts of interest to declare.

References

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