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Microbiology and Biotechnology Letters

Research Article(보문)

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Fermentation Microbiology (FM)  |  Microbial Community

Microbiol. Biotechnol. Lett. 2024; 52(3): 304-313

https://doi.org/10.48022/mbl.2406.06001

Received: June 5, 2024; Revised: August 6, 2024; Accepted: August 8, 2024

재배지역에 따른 절임배추 및 김치의 미생물 군집 분석

Analysis of Microbial Communities of Salted Cabbage and Kimchi according to Cultivation Areas

Chang Eun Kim1, Soo Hyun Kim1, Min Seo Jung2, and Seung Lim Lee3*

1Guwoon Food & Research Institute, Hoengseong 25246, Republic of Korea
2Pyeongchang Kkotsooni Co., Ltd., Pyeongchang 25330, Republic of Korea
3Department of Food and Nutrition, Wonju 26339, Republic of Korea

Correspondence to :
Seung Lim Lee,       luce2035@sangji.ac.kr

Abstract

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In this study, the microbial distribution and diversity of kimchi manufactured in the same method as salted cabbage manufactured from Pyeongchang, Andong, and Haenam cabbage according to the storage period were compared. Among Pyeongchang, Andong, and Haenam salted cabbages, the Haenam salted cabbage microbial community showed the highest diversity on the 1st day of storage. As the storage period of salted cabbage increased, the alpha diversity value increased, the proportion of cyanobacteria decreased, and bacteria derived from sea salt and water increased. Principal coordinates analysis(PCoA) and unweighted pair group method with arithmetic mean(UPGMA) trees showed that Andong salted cabbage on the 5th day of storage had a microbial community close to salted cabbage on the 10th day of storage. At the species level, Sinocapsa zengkensis was 78.65%, 90.64%, and 63.44%, respectively, in Pyeongchang, Andong, and Haenam salted cabbages on the 1st day of storage. Marinomonas primoryensis was showed in Pyeongchang, Andong, and Haenam salted cabbage on the 5th day of storage at 24.39%, 26.60%, and 21.75%, respectively, and at 42.17%, 31.43%, and 45.21%, respectively, on the 10th day of storage. Kimchi made from Pyeongchang, Andong, and Haenam salted cabbages showed Janthinobacterium lividum at 30.47%, 29.60%, and 25.97%, respectively. In addition, Leuconostoc spp. involved in fermentation were showed from the 5th day of storage, but Andong salted cabbage on the 10th day of storage was not showed. These results show to be due to differences in soil, climate, and cultivation methods of cabbage.

Keywords: Salted cabbage, kimchi, next generation sequencing, microbial community

Graphical Abstract


서론

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김장철이라는 말이 있듯이 절기상 입동 전후로 김치를 대량으로 담가 저장하는 김장은 한국에만 있는 독특한 문화이다. 김치는 삼국시대부터 이어지던 절임식품 발달의 결정체로 고추가루 및 달인 젓국을 사용한 양념김치의 본격적인 등장은 19세기(조선후기)에 이르러서 시작된 것으로 보인다[1].통상적으로 김치는 포기김치를 떠올리게 되지만 김치 및 절임류의 종류는 재료별로 구분하면 339종이나 되며 김치에사용되는 재료는 무 23%, 배추 17%, 기타 채소 37%, 과실류4%, 동물성 및 해조류가 9%로 나타나 지리적 환경 및 염장기술의 발달이 국가 및 지역고유의 문화를 만든 것으로 보인다[2]. 특히 강원도의 김치는 명태 및 오징어와 같은 수산물이 부재료로 사용되며 경상도 및 전라도 김치는 염도가 높고 감칠맛을 내는 젓갈류를 많이 사용하는 것이 특징이다[3].

김치의 주원료인 배추는 호냉성(好冷性) 작물로 생육초기에는 18−20℃, 배추의 속이 차는 결구기에는 15−18℃로 여름철 평지에서 재배가 어려워 지형적 요소를 이용한 고랭지재배 및 가을 재배가 주로 이루어지는 작목이다[4]. 특히 고랭지 재배는 평지에 비해 낮은 온도를 이용하여 작물을 재배하는 것으로 해발 400−600 m를 준고랭지, 600 m 이상을고랭지로 구분하며 1년에 한 번 무, 배추, 당근 및 감자 등이재배되며 이 중 배추 및 감자가 가장 많이 재배되고 있는 작목이다[5]. 고랭지 배추는 강원도가 4,069 ha로 전국의 92%,경상북도가 287 ha로 6%를 차지하고 있으며 2023년도 기준 배추의 시도별 재배면적 및 생산량은 강원도가 6,938 ha에서 387,541 t, 경상북도가 3,824 ha에서 252,074 t 및 전라남도가 8,640 ha에서 718,481 t을 나타내며 겨울배추는 전라남도가 3,905 ha로 전국의 98%를 차지하고 있다[6].

김치는 제조공정에서 배추의 수확, 선별, 세척 및 절임 등일련의 반복적인 과정을 필요로 한다. 특히 절임공정은 김치제조에 있어서 노동력 및 많은 시간을 소모할 뿐만 아니라김치의 품질에 영향을 미치는 중요한 공정이므로 절임배추를 구매하여 사용하는 것이 선호되고 있다[7]. 또한 1990년대 후반부터 시작된 절임배추의 상품화는 소규모 농가뿐만아니라 김치 제조 업체의 새로운 소득원으로서 자리잡고 있으며[8] 이에 따라 절임수, 제조공정 및 저장 중 품질변화 등절임배추에 대한 여러 연구가 이루어져 있으나 김치에 비해미생물 군집에 관한 연구는 미흡하다[9−11].

따라서 본 연구에서는 2022년도 시도별 생산량 기준으로강원도, 경상북도 및 전라남도의 각각 한 개 지역에서 재배된 배추를 수집하여 동일한 조건에서 절여 저장기간에 따른미생물 분포와 다양성을 비교하고자 하였으며 동일한 양념및 지역 별 절임배추로 제조한 김치의 미생물 군집에 대한자료를 제시하고자 하였다.

재료 및 방법

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실험 재료 제조

강원도, 경상북도 및 전라남도 각각의 대표적인 배추 주산지 평창, 안동 및 해남에서 재배된 배추로 절임배추 및 김치를 제조하였으며 평창꽃순이㈜농업회사법인으로부터 제공받아 사용하였다. 각각의 배추는 약 3 kg 이하로 선별하였고배추의 주산지는 고도에 따라 평창(600 m 이상), 안동(400− 600 m) 및 해남(400 m 이하)으로 구분되었으며 품종은 평창 휘파람골드, 안동 천고마비 및 해남 불암3호를 사용하였다. 절임배추의 제조는 전라남도 신안군에서 2년간 간수를제거한 천일염을 제공받아 염도 11%에서 배추를 16시간동안 절인 후 자동세척기로 3회 세척하여 30분간 탈수하였다.지역 별 절임배추로 제조한 김치는 절임배추 및 양념을 7:3비율로 혼합하여 제조하였으며 김치의 제조에 사용된 재료는 Table 1에 표시하였다. 절임배추 및 김치는 각각polyethylene bag에 포장한 후 4℃에서 보관하며 실험에 사용하였다.

Table 1 . Composition ratio of ingredients used for making kimchi.

IngredientsComposition (%)
Red pepper powder12.0
Radish44.5
Garlic10.0
Ginger2.5
Anchovy sauce4.0
Shrimp sauce5.0
Mustard greens4.0
Green onion4.0
Onion5.0
Glutinous rice paste5.5
Pear1.0
Apple1.0
Asian chives1.5
Total100


미생물 군집 분석

차세대 염기서열(Next-generation sequencing, NGS) 분석을 위해 저장 1, 5 및 10일차 평창, 안동 및 해남 절임배추의 소스와 지역 별 절임배추 3종으로 제조한 저장 3일차 김치의 소스만을 15 ml conical tube에 채취하여 ㈜마크로젠(Republic of Korea)에 metagenome amplicon sequencing을 의뢰하여 PaBio사의 Sequel II system을 이용한 single-molecule real-time (SMRT) sequencing을 수행하였다. DNA의 추출은 DNeasyPowerSoil Pro kit (Qiagen, Germany)를 사용하여 제조사의 방법에 따라 수행하였으며 추출된DNA는 Quant-IT PicoGreen (Invitrogen, USA)을 사용하여 정량화 하였다. 추출한 dsDNA는 VICTOR NivoTM multimode plate reader (Promega Corp., USA) 및 QuantiFluor® dsDNA system (PerkinElmer Inc., USA)을사용하여 정량화 하였다. gDNA의 확인은 2100 Bioanalyzer system (Agilent Tech., USA)을 사용하였으며 long-read sequencing을 위한 gDNA의 사이즈 정량은 Femto Pulse system (Agilent Tech.)을 사용하여 수행하였다. 추출한gDNA(2 ng)는 10× LA PCR Buffer II (Mg2+free), 2.5 mM의dNTP, 2.5 mM MgCl2, 각각 500 nM의 F/R PCR 프라이머 및 5U의 TaKaRa LA Taq (Takara, Japan)을 사용하여PCR로 증폭하였다. 16S rRNA 유전자의 증폭을 위해 범용프라이머 27F(5’-AGRGTTYGATYMTGGCTCAG-3’)와1492R(5’-RGYTACCTTGTTACGACTT-3’)을 사용하였으며PCR의 반응 조건은 94℃에서 5분(pre-denaturation), 94℃에서 30초(denaturation), 53℃에서 30초(annealing), 72℃에서 90초간 25회(extension) 반복하였고 72℃에서 5분 반응(final extension)을 수행하였다. PCR 산물은 SMRTbell cleanup beads (Pacific Biosciences, USA)로 정제하였으며정제된 산물은 Quant-IT PicoGreen (Invitrogen)을 사용하여 정량화하고 TapeStation D5000 Screen Tape (Agilent Tech.)로 확인하였다. DNA 라이브러리는 PacBio SMRTbell prep kit 3.0. (Pacific Biosciences, USA)을 사용하여 제작하였고 PCR 농축 단편의 크기 및 라이브러리의 확인을 위해2100 Bioanalyzer system (Agilent Tech.)를 사용하였다. 시퀀싱 후 raw data의 프라이머는 Cutadapt v3.2를 사용하여제거하였고 amplicon sequence variant (ASV)의 시퀀싱은MiSeq platform (Illumina, USA)을 사용하여 divisive amplicon denoising algorithm 2 (DADA2) v1.18.0 pipeline으로 denoising 및 chimera를 제거하여 ASV를 구성하였다. 각ASV는 basic local alignment search tool (BLAST+)를 사용하여 NCBI 16S rRNA database에서 유사성이 가장 높은미생물로 분류가 이루어졌으며 미생물 군집 구조 분석에서는 quantitative insights into microbial ecology (QIIME) v1.9.0가 사용되었다. 다양성 분석 및 ASV의 계통수 작성을위해 MAFFT v7.475 및 FastTreeMP v2.1.10을 사용하였고지역 별 절임배추 및 김치의 미생물 군집 내 다양성은 alpha-diversity 지표인 Shanon, Gini-Simpson 및 phylogenetic diversity (PD)_whole_tree index로 산정하였다. Alpha-diversity는 좁은 공간의 다양성을 의미하며 개별 표본 내에서 미생물 종의 풍부도(수와 비율) 및 다양성 지수로 표현하고 샘플간에 비교가 가능하다[12]. 특히 Shannon 및 Gini-Simpson index는 군집 내 미생물이 얼마나 균일한 측면을나타내는지 확인하는 척도로 Shannon index는 종의 수와 균등성에 영향을 받으며 더 많은 수의 종과 균일한 분포가 수치를 증가시키는 다양성을 나타낸다. 즉 수치가 높을수록 모든 종이 거의 동일하게 풍부하다는 것을 의미한다. Gini-Simpson index는 군집 내에서 무작위로 선택된 두 개체가동일한 종에 속할 확률로 측정된다. 범위는 0−1이며 값이 0에 가까우면 다양성의 부족, 1에 가까우면 군집 내 모든 분류 군이 동일하게 존재한다는 것을 의미한다[13]. 2개 이상의 샘플이 가지고 있는 미생물 군집의 다양성을 파악할 때사용되는 beta-diversity는 차원 축소를 통해 샘플 사이의 거리를 좌표로 표시한 principal coordinates analysis (PCoA)및 샘플 간 다양성의 거리를 측정하여 샘플 간 차이를 한눈에 보기 쉽게 표시한 unweighted pair group method with arithmetic mean (UPGMA) tree를 통해 시각화하였다.

결과 및 고찰

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저장기간에 따른 지역 별 절임배추 및 김치의 alpha-diversity

12개 샘플에 대한 raw data와 함께 alpha-diversity 분석결과를 Table 2에 나타내었다. 저장 1일차 평창, 안동 및 해남 절임배추 HiFi read의 총 base는 각각 69.2, 70.6 및 68.4 Mbp, 평균적으로 읽은 HiFi read 길이는 각각 1,483, 1,482 및 1,484 bp였다. 저장 5일차 평창, 안동 및 해남 절임배추 HiFi read의 총 base는 각각 65.4, 67.5 및 77.9 Mbp,평균적으로 읽은 HiFi read 길이는 각각 1,500, 1,503 및1,496 bp였다. 저장 10일차 평창, 안동 및 해남 절임배추HiFi read의 총 base는 각각 60.8, 54.9 및 54.4 Mbp, 평균적으로 읽은 HiFi read 길이는 각각 1,502, 1,502 및 1,501 bp였다. 평창, 안동 및 해남 절임배추로 제조한 김치 HiFi read의 총 base는 각각 78.1, 82.7 및 58.3 Mbp, 평균적으로 읽은 HiFi read 길이는 각각 1,500, 1502 및 1496 bp였다. 최근까지 분석되고 있는 operational taxonomic units (OTU)는 de novo 및 closed-reference OTU-picking으로 97% 기준 오류 시퀀스를 포함한 유사 시퀀스를 통합하는 방법으로single nucleotide polymorphism (SNP)와 같은 생물학적 변이는 손실되는 단점을 가지고 있지만 ASV는 오류가 포함된시퀀스보다 정상적인 시퀀스가 반복될 확률이 높은 추론에따라 분류하며 OTU와 달리 유사성 및 유전체 데이터베이스의 참고 없이 전체 유전체를 분석하는 정확성과 효율성을 가지고 있다[14]. ASV는 저장 1일차 평창, 안동 및 해남 절임배추에서 각각 89, 64 및 115개, 저장 5일차 평창, 안동 및 해남 절임배추에서 각각 74, 83 및 103개, 저장 10일차 평창,안동 및 해남 절임배추에서 각각 58, 49 및 58개, 평창, 안동및 해남 절임배추로 제조한 김치는 163, 149 및 104개로 확인하였다.

Table 2 . Sequence summary and alpha-diversity indices.

SampleHiFi read base (Mbp)Average read (bp)ASVShannonGini-SimpsonPD_whole_tree
PC_169.21,483891.9960.3806.203
AD_170.61,482640.9470.1785.909
HN_168.41,4841153.1030.5946.922
PC_565.41,500744.5710.9155.125
AD_567.51,503835.0650.9545.032
HN_577.91,4961034.9030.9326.663
PC_1060.81,502584.3620.9154.200
AD_1054.91,502494.5960.9413.091
HN_1054.41,501584.2890.9104.553
PC_K78.11,5001635.6560.9618.366
AD_K82.71,5021495.7150.9637.750
HN_K58.31,4961045.6200.9646.609

PC_1, Pyeongchang salted cabbage on the 1st day of storage; AD_1, Andong salted cabbage on the 1st day of storage; HN_1, Haenam salted cabbage on the 1st day of storage; PC_5, Pyeongchang salted cabbage on the 5th day of storage; AD_5, Andong salted cabbage on the 5th day of storage; HN_5, Haenam salted cabbage on the 5th day of storage; PC_10, Pyeongchang salted cabbage on the 10th day of storage; AD_10, Andong salted cabbage on the 10th day of storage; HN_10, Haenam salted cabbage on the 10th day of storage; PC_K, Kimchi made from Pyeongchang salted cabbage on the 3th day of storage; AD_K, Kimchi made from Andong salted cabbage on the 3th day of storage; HN_K, Kimchi made from Haenam salted cabbage on the 3th day of storage.

Shannon 값은 저장 1일차 평창, 안동 및 해남 절임배추에서 각각 1.996, 0.947 및 3.103, 저장 5일차 평창, 안동 및 해남 절임배추에서 4.571, 5.065 및 4.903, 저장 10일차 평창,안동 및 해남 절임배추에서 4.362, 4.596 및 4.289로 나타나절임배추의 저장기간이 증가함에 따라 Shannon 값이 증가하였다. 배추의 작부체계에 있어 돌려짓기 및 이어짓기 작부는 토양의 이화학적 변화 및 배추의 생산성에 유의적 차이를 나타내지 않지만 토양의 세균 및 곰팡이 군집의 다양성은 작물을 순서에 따라 주기적으로 교체하여 재배하는 돌려짓기보다 같은 작물을 동일한 곳에서 재배하는 이어짓기에서 낮게 나타나며 세균 군집은 작물 재배 후 작부체계와 상관없이 다양성이 감소하고 이어짓기에서 유의적으로 낮은다양성을 나타낸다고 보고된 바 있다[15]. 이러한 지역, 기후및 재배적 특성이 저장 1일차 절임배추 미생물의 다양성에기인한 것으로 사료되며 특히 저장 1일차 해남 절임배추 미생물 군집의 다양성이 가장 높은 것으로 나타났다. 저장 1일차 평창, 안동 및 해남 절임배추로 제조한 김치의 Shannon값은 5.656, 5.715 및 5.620으로 절임배추에 비해 미생물 군집의 다양성이 증가하였음을 확인하였다. NGS 분석에 있어배추 및 양념 부재료의 DNA 간섭을 피하기 위해 절임배추및 김치의 소스만을 사용하였고 김치는 제조 직후 소스 채취의 어려움으로 4℃에서 3일간 저장 후 채취하였다. 이 과정에서 발효가 진행되었을 것으로 생각된다. 따라서 Shannon는 저장 1일차 지역 별 절임배추 3종으로 각각 제조한 김치에서 가장 높게 나타났으며 이는 양념에 첨가된 부재료 및저온저장에 의한 것으로 사료된다. Rarefaction curve는ASV, Shannon, Gini-Simpson 및 PD_whole_tree index에따라 나타내었으며 각각의 시료 모두 flat한 포화상태로 근접하는 형태로 나타나 적절한 미생물 종의 정보를 반영하는시퀀싱 데이터임을 확인하였다(Fig. 1). 또한 저장일수에 따른 절임배추 및 김치의 다양성은 alpha-diversity index에 따라 heat map 형태로 나타내었다(Fig. 2).

Figure 1.Rarefaction curves of storage period of salted cabbage and kimchi based on alpha-diversity indices at ASV (A), Shannon (B), Gini-Simpson (C) and PD_whole_tree (D). PC_1, Pyeongchang salted cabbage on the 1st day of storage; AD_1, Andong salted cabbage on the 1st day of storage; HN_1, Haenam salted cabbage on the 1st day of storage; PC_5, Pyeongchang salted cabbage on the 5th day of storage; AD_5, Andong salted cabbage on the 5th day of storage; HN_5, Haenam salted cabbage on the 5th day of storage; PC_10, Pyeongchang salted cabbage on the 10th day of storage; AD_10, Andong salted cabbage on the 10th day of storage; HN_10, Haenam salted cabbage on the 10th day of storage; PC_K, Kimchi made from Pyeongchang salted cabbage on the 3th day of storage; AD_K, Kimchi made from Andong salted cabbage on the 3th day of storage; HN_K, Kimchi made from Haenam salted cabbage on the 3th day of storage.

Figure 2.Boxplot of storage of period of salted cabbage and of kimchi based on alpha-diversity indices at ASV (A), Shannon (B), Gini-Simpson (C) and PD_whole_tree (D).

저장기간에 따른 지역 별 절임배추 및 김치 미생물 군집의 beta-diversity

저장기간에 따른 평창, 안동 및 해남 절임배추 미생물 군집간의 변화를 Bray-curtis dissimilarity를 사용하여 PCoA및 UPGMA tree를 통해 시각화하였다. Bray-curtis는 생태학 분야에서 널리 사용되는 방법 중 하나로 지점 간 출현 개체수 및 종수를 고려하여 유사도를 정량화하는 방법이다[16]. PCoA를 통해 확인한 샘플 간 미생물 군집 유사도의 경향성은 시료에 따라 그룹화 하였으나 저장 5일차에서 1개의시료가 저장 10일차에 가깝게 나타났다(Fig. 3A). 또한UPGMA tree를 통해 저장 5일차 안동 절임배추의 미생물 군집이 저장 10일차 절임배추 미생물 군집과의 유사도의 경향이 비슷하였으며 PCoA의 결과가 UPGMA tree의 결과와 일치하는 것을 확인하였다(Fig. 3B). PCoA 그래프 각 축(PC1, PC2)에 대한 수치(%)는 전체 샘플에서 얼마큼의 결과를 대변하는가에 대한 표현으로 2D 좌표에서 설명력이 가장 높은요인을 PC1, 차순위가 PC2에 해당하며 종좌표보다 횡좌표에 위치한 미생물 군집이 절임배추 미생물 군집에 영향을 준다는 것을 의미한다. PC1 및 PC2 미생물 조성 차이에 대한설명력을 참고하여 그래프를 사용하는데 적절함을 확인하였다[17].

Figure 3.PCoA (A) and UPGMA (B) tree clustering result based on Bray-curtis dissmimilarity metric of bacterial communities on storage period of salted cabbage and kimchi. Kimchi, Kimchi made from salted cabbage in Pyeongchang, Andong and Haenam on the 3rd day of storage; Storage_1, Pyeongchang, Andong and Haenam salted cabbage on the 1st day of storage; Storage_10, Pyeongchang, Andong and Haenam salted cabbage on the 10th day of storage; Storage_5, Pyeongchang, Andong and Haenam salted cabbage on the 5th day of storage. PC_1, Pyeongchang salted cabbage on the 1st day of storage; AD_1, Andong salted cabbage on the 1st day of storage; HN_1, Haenam salted cabbage on the 1st day of storage; PC_5, Pyeongchang salted cabbage on the 5th day of storage; AD_5, Andong salted cabbage on the 5th day of storage; HN_5, Haenam salted cabbage on the 5th day of storage; PC_10, Pyeongchang salted cabbage on the 10th day of storage; AD_10, Andong salted cabbage on the 10th day of storage; HN_10, Haenam salted cabbage on the 10th day of storage; PC_K, Kimchi made from Pyeongchang salted cabbage on the 3th day of storage; AD_K, Kimchi made from Andong salted cabbage on the 3th day of storage; HN_K, Kimchi made from Haenam salted cabbage on the 3th day of storage.

저장기간에 따른 지역 별 절임배추 및 김치의 미생물의 문(phylum) 수준의 분포도 분석

저장 1, 5 및 10일차 지역 별 절임배추 및 김치 미생물의 상대적 분포도를 heat map 형태로 Fig. 4에 나타내었다. 문(phylum) 수준에서 1% 미만을 제외하고 확인하였으며 분석 시 엽록체 시퀀스는 따로 제거되지 않았고 NCBI 16S rRNA database에 대한 BLAST+ 결과에 따라 ASV1이 지정되었다. 저장 1일차 평창 절임배추는 Cyanobacteriota (78.93%), Pseudomonadota (16.71%) 및 Bacteroidota (4.18%), 안동 절임배추는 Cyanobacteriota (90.64%), Pseudomonadota (6.59%) 및 Bacteroidota (2.49%), 해남 절임배추는 Cyanobacteriota (63.44%), Pseudomonadota (28.40%) 및 Bacteroidota (7.61%) 순으로 확인되었다. 저장 1일차 절임 배추 모두 Cyanobacteriota가 우세한 비율로 나타났으며 안동, 평창 및 해남 순으로 나타났다. 남세균으로 불리는Cyanobacteriota는 cyanobacterium phylum을 나타내는 단어로 전자 공여체로서 물을 사용하여 산소 광합성을 수행하고탄소 공급원으로 이산화탄소를 환원하거나 이러한 유기체에서 2차적으로 진화한 유기체로 다른 원핵생물과 구분되는 생리학적 및 생화학적 특성을 가진 그람음성 박테리아다[18].고랭지 배추의 경우 다른 품종의 배추 대비 잎의 주맥인 중륵이 두꺼워 절임이 잘되지 않는 경향을 나타낸다고 보고된바 있고[19] 천일염의 농도 및 유산균이 cyanobacterium의 성장을 억제한다는 연구가 보고된 바 있다[20]. 따라서 배추가긴 시간 토양과 접촉을 이루고 있었고 염수에 침지되어 있던기간이 짧아 Cyanobacteriota가 우세한 비율로 나타났다고 사료된다. 저장 5일차 평창 절임배추는 Pseudomonadota (74.06%), Cyanobacteriota (22.74%) 및 Bacteroidota (2.15%),안동 절임배추는 Pseudomonadota (92.48%), Cyanobacteriota (5.42%) 및 Bacteroidota (1.39%), 해남 절임배추는Pseudomonadota (76.14%), Cyanobacteriota (18.88%) 및Bacteroidota (3.85%) 순으로 확인되었으며, 저장 10일차 평창 절임배추는 Pseudomonadota (96.79%) 및 Bacillota (2.62%), 안동 절임배추는 Pseudomonadota (99.05%), 해남절임배추는 Pseudomonadota (97.98%) 및 Bacteroidota (1.00%) 순으로 확인되어 지역 별 절임배추의 저장기간이 증가할수록 Pseudomonadota가 우세한 비율로 나타났다. Pseudomonadota는 2021년 Proteobacteria에서 이름이 변경된 문으로 Acidithiobacillia, Alphaproteobacteria, Betaproteobacteria, Deltaproteobacteria, Epsilonproteobacteria, Gammaproteobacteria, Hydrogenophilia 및 Oligoflexia의강(class)이 이 문에 속하며 대부분이 그람음성 박테리아이다. Escherichia, Salmonella, Vibrio, Yersinia 및 Legionella 같은 병원성 속과 식물 성장과 토양 비옥도에 중요한 역할을하는 질소 고정 박테리아가 이 문에 속하는 것으로 알려져있다[21]. Bacteroidota는 2021년 Bacteroidetes에서 이름이변경된 6개의 강(Bacteroidia, Chitinophagia, Cytophagia, Flavobacteriia, Saprospiria 및 Sphingobacteriia)을 포함하는 문으로 Bacteroidota에 속하는 박테리아는 토양, 해양 및성인 위장관 등 다양한 환경에서 서식하는 것으로 알려져 있다[22]. 생배추에서 나타나는 주요 문으로는 Proteobacteria및 Bacteroidetes가 전체서열의 90% 이상을 차지한다는 연구가 보고된 바 있어 문 수준에서 절임배추와 유사성을 나타냈다[23]. 저장 1일차 평창, 안동 및 해남 절임배추로 제조한 김치에서 평창 김치는 Pseudomonadota (49.02%), Bacillota (45.16%) 및 Cyanobacteriota (4.80%), 안동 김치는 Pseudomonadota (52.27%), Bacillota (37.57%) 및Cyanobacteriota (9.34%), 해남 김치는 Pseudomonadota (46.98%), Bacillota (38.64%), Cyanobacteriota (8.98%), Bacteroidota (3.30%) 및 Actinomycetota (1.17%) 순으로확인되었다. 저장 1일차 절임배추에서 우세한 비율을 보였던 Cyanobacteriota의 비율이 10% 미만으로 낮아졌고Pseudomonadota의 비율이 40% 이상으로 나타났다. 본 실험에서는 저장 1일차 절임배추를 사용하여 각각의 김치를 제조하였으며, 저장 1일차 절임배추에서 Bacillota는 1% 미만의 비율이었으나 양념 부재료와 혼합하여 제조한 저장 3일차 평창, 안동 및 해남김치에서 각각 45.16%, 37.57% 및38.64%를 나타내었다. 이는 Bacillota 문은 2021년 Firmicutes에서 이름이 변경된 박테리아 문으로 Bacilli 및 Clostridia등의 강을 포함하고 있으며 김치 발효에 관여하는 다양한 유산균을 포함하고 있어[24, 25] 평창 절임배추는 무, 고춧가루 및 마늘 등과 같은 부재료와 혼합되는 과정을 거치면서안동 및 해남 김치보다 발효가 잘 진행되고 있다고 생각해볼 수 있다.

Figure 4.Heat map at phylum level of storage period of salted cabbage and kimchi. PC_1, Pyeongchang salted cabbage on the 1st day of storage; AD_1, Andong salted cabbage on the 1st day of storage; HN_1, Haenam salted cabbage on the 1st day of storage; PC_5, Pyeongchang salted cabbage on the 5th day of storage; AD_5, Andong salted cabbage on the 5th day of storage; HN_5, Haenam salted cabbage on the 5th day of storage; PC_10, Pyeongchang salted cabbage on the 10th day of storage; AD_10, Andong salted cabbage on the 10th day of storage; HN_10, Haenam salted cabbage on the 10th day of storage; PC_K, Kimchi made from Pyeongchang salted cabbage on the 3th day of storage; AD_K, Kimchi made from Andong salted cabbage on the 3th day of storage; HN_K, Kimchi made from Haenam salted cabbage on the 3th day of storage.

저장기간에 따른 지역 별 절임배추 및 김치의 미생물의 종(species) 수준의 분포도 분석

종수준에서 저장 1, 5 및 10일차 지역 별 절임배추 및 김치의 주요 우점종을 확인하였으며 heat map 형태로 Fig. 5에 나타내었다. 저장 1일차 평창, 안동 및 해남 절임배추에서 Sinocapsa zengkensis가 각각 78.65%, 90.64% 및63.44%로 우점종임을 확인하였다. S. zengkensis는 16S rRNA 유전자 서열이 Aliterella antarctica CENA408와94.13%의 상동성을 나타내며 형태 또한 유사한 미생물로 중국 푸젠성의 Zengkeng마을의 콘크리트에서 분리되어 새롭게 확립된 육상 구균성 남세균이다[26]. 저장 5일차 평창, 안동 및 해남 절임배추는 Marinomonas primoryensis가 각각24.39%, 26.60% 및 21.75%로 우점종임을 확인하였다. M. primoryensis는 러시아 블라디보스토크 인근 일본 아무르스키 만의 해빙에서 분리되었으며 4−30℃에서 생장이 가능한호냉성 미생물이다[27]. 또한 북극 Spitzbergen의 해빙 및 해수 샘플에서 분리된 Psychromonas arctica가 평창, 안동 및해남 절임배추에서 각각 1.61%, 14.46% 및 2.80%로 나타났다. 이 외에도 해양 퇴적물에서 분리된 M. arenicola [28], 육류 공정 염수에서 분리된 Vibrio hibernica [29] 등 저장 5일차 절임배추부터 저온에서 염수에 침지되어 있는 기간이 증가함에 따라 천일염에서 유래한 미생물의 증식이 증가한 것으로 사료된다. 이 외에도 평창 절임배추에서 Leuconostoc gasicomitatum 0.30%, L. gelidum 0.49% 및 L. inhae 0.03%가 검출되었으며 안동 절임배추에서 L. gelidum 0.13%, 해남절임배추에서 L. gelidum 0.28%가 검출되었다. 저장 10일차평창, 안동 및 해남 절임배추는 M. primoryensis가 42.17%, 31.43% 및 45.21%로 우점종임을 확인하였다. 이 외에도 L. gasicomitatum 및 L. gelidum이 평창 절임배추에서 1.11%및 1.28%, 해남 절임배추에서 0.19% 및 0.74%가 검출되었으며 안동 절임배추는 검출되지 않았다. Björkroth 등은 L. gelidum과 유사한 L. gasicomitatum이 육류 및 가금류 제품에서 발생하는 부패종으로 보고한 바 있어[30] 본 실험에서L. gelidum 및 L. gasicomitatum이 증가하여 부패가 시작되는 것으로 판단하였다. 하지만 이전 연구와 달리 L. gelidum이 김치 발효 초기 저온에서 대표적으로 나타나는 Leuconostoc종으로 보고된 바 있어[31] 저장 5일차부터 절임배추의 발효가 진행되고 있다고 사료된다. 또한 염수량, 절임배추의 외관 및 관능적 특성에 기인하여 염수에 침지된 절임배추는 최대저장기간이 2주 이내로 보고된 바 있고[32] 평창, 안동 및해남 절임배추의 저장기간이 증가하며 절임배추에서 뚜렷하게 증가하는 부패종은 없지만 Pseudomonas fragi와 같은 유제품 부패종이 절임배추 내 꾸준히 검출되고 있어 관능적 특성까지 고려하여 2주 내로 빠르게 사용하는 것이 효과적이라고 사료된다(Fig. 5). 저장 1일차 평창, 안동 및 해남 절임배추로 제조한 김치는 각각 Janthinobacterium lividum이30.47%, 29.60% 및 25.97%로 우점종임을 확인하였다. J. lividum은 짙은 보라색 색상의 그람음성 박테리아로 숲의토양, 빙하, 호수 및 강가 등 다양한 환경에서 분리되며 항박테리아, 항바이러스 및 항진균의 특성을 나타내는 2차 대사산물인 violacein을 생성하는 것으로 알려져 있다[33]. 이러한 결과들을 통해 저장 1일차 해남 절임배추 미생물 군집의 다양성이 가장 높았고 절임배추 모두 동일하게 저장기간이 증가할수록 남세균의 비율이 감소하고 저온 및 천일염에서 유래한 미생물의 비율이 증가하는 것을 확인하였다. 저장1일차 평창, 안동 및 해남 절임배추로 제조한 김치는 절임배추와 비교하여 유산균이 증가하였고 J. lividum의 검출은 양념의 부재료 첨가로 인한 것으로 생각되며 절임배추에 따라미생물의 검출이 다르게 나타난 것으로 사료된다. Jung 등[34]은 재배지역이 다른 시판 절임배추로 김치를 제조하였을때 저장 3일만에 유산균의 비중이 높다고 보고하여 본 연구와 상이한 결과를 나타냈다. 이러한 결과는 배추의 토양, 기후 및 재배 방식의 차이 때문에 나타난 것으로 이를 통해 품질이 균일화된 절임배추 및 소비자가 원하는 숙성 조건의 김치를 제공하는 기초 자료로 활용될 수 있을 것으로 판단되며 품질에 대한 추가적인 연구가 필요한 것으로 보인다.

Figure 5.Heat map at species level of storage period of salted cabbage and kimchi. PC_1, Pyeongchang salted cabbage on the 1st day of storage; AD_1, Andong salted cabbage on the 1st day of storage; HN_1, Haenam salted cabbage on the 1st day of storage; PC_5, Pyeongchang salted cabbage on the 5th day of storage; AD_5, Andong salted cabbage on the 5th day of storage; HN_5, Haenam salted cabbage on the 5th day of storage; PC_10, Pyeongchang salted cabbage on the 10th day of storage; AD_10, Andong salted cabbage on the 10th day of storage; HN_10, Haenam salted cabbage on the 10th day of storage; PC_K, Kimchi made from Pyeongchang salted cabbage on the 3th day of storage; AD_K, Kimchi made from Andong salted cabbage on the 3th day of storage; HN_K, Kimchi made from Haenam salted cabbage on the 3th day of storage.

요약

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강원도 평창, 경상북도 안동 및 전라남도 해남에서 각각재배된 배추를 수집하여 동일한 조건에서 절여 저장기간에따른 미생물 군집의 변화와 동일한 양념을 사용하여 제조한김치의 미생물 군집을 비교하였다. 저장 1일차 평창, 안동 및해남 절임배추 중 해남 절임배추 미생물 군집의 다양성이 가장 높았고 저장 5일 및 10일차 절임배추에서 공통적으로 유사한 결과를 나타냈다. 저장 1일차 절임배추로 제조한 김치는 절임배추와 비교하여 미생물 군집의 다양성이 증가하였다. 저장 1일차 절임배추는 육상 구균성 남세균인 S. zengkensis, 저장 5일 및 10일차 절임배추는 해빙에서 분리된 M. primoryensis가 우점균임을 확인하였다. 저장 5일차평창, 안동 및 해남 절임배추에서 Leuconostoc spp.가 각각0.82%, 0.13% 및 0.28%, 저장 10일차 평창 및 해남 절임배추에서 각각 2.39% 및 0.93%의 Leuconostoc spp.가 검출되었다. 저장 1일차 평창, 안동 및 해남 절임배추로 제조한 김치는 항박테리아, 항바이러스 및 항진균의 특성을 나타내는 J. lividum이 우점종임을 확인하였으며, Leuconostoc spp.등 발효과정 및 저온저장 김치에서 발견되는 미생물들의 생육이 이루어지고 있음을 확인하였다.

Acknowledgments

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This study was conducted in 2023 with support for technical support projects from the Korea SMEs and Startups Agency.

Conflict of Interest

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The authors have no financial conflicts of interest to declare.

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