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Microbiology and Biotechnology Letters

Research Article(보문)

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Food Microbiology (FM)  |  Bioactive Compounds or Metabolites: Function and Application

Microbiol. Biotechnol. Lett. 2024; 52(3): 255-263

https://doi.org/10.48022/mbl.2405.05004

Received: May 10, 2024; Revised: July 16, 2024; Accepted: July 25, 2024

카이란(Brassica oleracea L.) 추출물의 대식세포 내에서 LPS에 의한 염증 반응 억제 효과

Inhibitory Effect of Kailan (Brassica oleracea L.) Extract on LPS-Induced Inflammatory Response in Macrophages

DanHee Yoo1 and In Chul Lee2*

1College of Fusion and Convergence, 2Department of Bio-Cosmetic Science, Seowon University, Cheongju 28674, Republic of Korea

Correspondence to :
InChul Lee,       5229418@hanmail.net

In this study, antioxidant and anti-inflammatory activity was studied to confirm the value of kailan (Brassica oleracea L.) as a natural material for cosmetics. For this study measure the antioxidative activity, total polyphenol content was measured, and DPPH and ABTS scavenging activity assays were conducted. As a result of measuring the total polyphenol content of hot water extract of kailan (KRD) and 70% ethanol extract of kailan (KRE), it was found to contain 124.3 mg TAE/100 g and 144.1 mg TAE/100 g, respectively. As a result of DPPH and ABTS radical scavenging ability, it was confirmed that the efficacy was concentration dependent. After treating the cells with LPS, a stimulant, for 2 hours, an experiment was conducted by treating RAW 264.7 cells with KRD and KRE at concentrations of 10, 50, and 100 μg/ml. The nitric oxide production inhibitory activity of KRD and KRE showed an inhibitory effect of about 30% at a concentration of 100 μg/ml. Cells cultured for 18 hours after stimulant treatment were obtained and used in experiments. The cells obtained in this way were lysed, protein and mRNA were extracted, and the expression of inflammatory mediators’ inducible nitric oxide synthase (iNOS) and cyclooxygenase-2 (COX-2) was confirmed. It was confirmed that the protein mRNA expression of iNOS and COX-2, measured through western blot and reverse transcription-PCR, was inhibited in a concentration-dependent manner. Based on this, it is judged that has the potential to be used as a natural material in cosmetics.

Keywords: Antioxidant, anti-inflammatory, kailan, Brassica oleracea L., natural material

Graphical Abstract


현대사회는 과거에 비해 늘어난 평균수명으로 인하여 외적인 아름다움과 노화에 대한 관심이 증가하고 있는 추세이다. 환경에 대한 중요성이 전 세계적인 이슈로 부각되면서,최근 건강한 피부와 함께 환경을 중시하면서 지속적인 아름다움을 추구하는 친환경적이고 합리적인 소비패턴이 나타나고 있다고 보고된 바 있다[1]. 또한 현대 바이오 기술 진화에따라 소비자들의 요구가 화학·물리적 유래 원료 중심의 일반 화장품에서 생물·자연적 원료 기반의 기능성 화장품으로 변화되고 있다. 대표적인 천연 항산화제로는 식물로부터 분리한 플라보노이드(flavonoid), 알파-토코페롤(α-tocopherol), 아스코르빅산(ascorbic acid) 등이 있으며, 합성 항산화물질에는 부틸하이드록시아니솔(butylated hydroxyanisole, BHA),부틸하이드록시 톨루엔(butylated hydroxytoluene, BHT) 등이 있다. 합성 항산화 물질은 과다섭취에 따른 독성, 알러지등의 안정성 문제로 사용이 제한되어 이에 대한 대체제로 천연 항산화 물질 개발을 위한 연구가 진행되고 있다[2].

염증 반응은 생체나 조직에서 세균감염, 화학적 물질, 물리적 자극 등의 기질적 변화를 가져오는 피해가 발생할 때그 피해에 저항하고 손상 부위를 수복하려는 기전이다. 하지만 극심한 염증 반응은 주변 조직을 손상시키고 상태를 악화시키거나 새로운 질병을 유도한다[3]. 활성화된 대식세포는 염증 반응으로 질소 화합물 및 다양한 cytokine을 생성한다[4]. 하지만 과도하고 지속적인 염증 매개 물질의 발현은만성 염증 질환 및 종양 등의 유발 원인이 되기도 한다. Interleukin (IL)-1β와 tumor necrosis factor-α (TNF-α) 등의 염증성 cytokine의 발현이 유도되어 호중구를 활성화하여 염증 부위로 이동시키고 inducible nitric oxide synthase (iNOS), cyclooxygenases (COX-2)를 코딩하는 유전자의 발현을 자극함으로서 염증 반응에 관여하는 반응성 물질인nitric oxide (NO), prostaglandin E2 (PGE2)를 생성하게 하여 염증반응이 일어나게 된다[5].

카이란(Brassica oleracea L.)은 브로콜리, 케일과 비슷한계열의 양배추 과로 중국 케일, kailan 또는 galin으로도 알려져 있다. 짙은 녹색 잎을 가지고 있는 것이 특징이며, 맛은 브로콜리와 비슷한 단맛과 케일 같은 쌉싸름 한 맛을 가지고 있다. Kailan은 보통 줄기 부분을 사용하며 중국 남부와 동남아시아 지역에서 식재료로 사용되고 있는 채소 중 하나이다. Brassica 종에는 glucosinolates라는 천연 항산화제성분이 포함되어 있어 항산화 능력이 좋고 산화 스트레스,염증 및 암을 예방할 수 있다는 것이 보고된 바 있다[6].

현재까지 카이란(Brassica oleracea L.)에 대해 수행된 생리활성과 관련된 선행연구가 진행되지 않고 있으므로, 천연소재로서의 연구가 부족한 실정이다. 따라서 본 연구에서는카이란(Brassica oleracea L.)의 열수 추출물과 70% 에탄올추출물을 대상으로 대식세포인 RAW 264.7의 세포 생존율과 lipopolysaccharide (LPS)로 유발된 대식세포 RAW 264.7의 NO 생성 저해율 등의 cytokine 생성에 미치는 영향으로 항염증 효과를 조사하고 항산화 효과의 여부를 확인함으로써 화장품 분야에서 천연 기능성 소재로 활용 가능성을확인하고자 한다.

재료 및 시료 추출

본 실험에 사용된 카이란은 대한민국 경기도 안산시 상록구의 안산팜에서 구입하였으며, 카이란 세척 후 건조기를 이용하여 80℃에서 24시간 이상 열풍건조 시킨 후 파쇄하여사용하였다. 카이란 열수 추출물을 만들기 위해 10배의 증류수를 가해 3시간 환류 냉각을 3번 거처 100℃에서 침지시켰다. 이후 부직포를 이용하여 침전물과 상등액을 분리시켰다. 카이란 에탄올 추출물을 만들기 위해 10배의 70% 에탄올을 가하여 24시간동안 교반추출 하였으며 3반복으로 진행하였다. 이후 부직포를 이용하여 침전물과 상등액을 분리시켰다. 이후 상등액은 진공펌프와 여과지(Whatman NO. 4, NO. 2, NO. 5)를 이용하여 2차 여과를 진행하였으며, rotary vacuum evaporator를 사용하여 감압농축을 통해 용매를 제거하였다. 농축된 추출물은 동결건조를 진행하여 분말 형태의 추출물로 만들었으며, -20℃에 보관하여 본 시험의 사용하였다. 카이란의 열수 및 70% 에탄올 추출물은 각각44.26%, 27.5%의 수율을 확인하였다.

시약 및 기기

총 폴리페놀 함량, 전자공여능, ABTS 라디칼 소거능 측정을 위해 사용한 Folin-ciocalteu reagent (Folin), Tannic acid, Ascorbic acid, 1-1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), 2,2’-azinobis-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)(ABTS) 등은 Sigma Chemical Co. (USA)에서 구입하였으며, Na2CO3은 Kanto Chemical Co. (Japan)에서 구입하여 사용하였다. 세포배양을 위해 사용된 세포 주는 대식세포인RAW 264.7을 ATCC (USA)에서 분양 받았으며, 배양에 사용된 dulbecco’s modified eagle medium (DMEM), fetal bovin serum (FBS), penicillin/streptomycin은 Cytiva hyclone (England)에서 구입하여 사용하였다. 세포 생존율을 측정하기 위해 사용한 3-[4,5-dimethylthiazol]-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT)와 dimethyl sulfoxide (DMSO)는Sigma Chemical Co.에서 구입하였다. Western blot을 진행하기 위해 염증 매개 인자인 iNOS 및 COX-2, housekeeping gene인 β-actin과 anti-mouse는 Santa Cruz Biotechnology, Inc. (USA)에서 구입하여 사용하였다. 단백질 band 확인을위해 반응 시약인 Enhanced chemiluminescence (ECL)은Merck Millipore (USA)에서 구입하여 사용하였다. RT-PCR을 통해 mRNA 발현을 측정하기 위해 사용된 Trizol reagent는 Thermo Fisher Scientific (USA)에서 구입하였고Accupower PCR PreMix, Go Script Reverse Transcription kits는 Bioneer (Republic of Korea)와 Promega (USA)에서구입하여 사용하였다. primer로 사용된 iNOS, COX-2 및GAPDH는 Bionics (Republic of Korea)에서 구입하였다.

본 연구에 사용된 기기는 Rotary vacuum evaporator (EYELA, Japan), ELISA readers (Molecular Devices, China), CO2 incubator (Panasonic Healthcare Co., Japan), Micro refrigerated centrifuge (Hanil Scientific Inc., Republic of Korea), Nano drop (Jcbio, Republic of Korea), ChemiDocTM MP Imaging System (Bio-Rad, USA) 등을 사용하였다.

총 폴리페놀 함량 측정

총 폴리페놀 함량은 Folin-ciocalteu법[7]을 변형하여 실험을 진행하였다. 표준물질은 tannic acid를 농도별로 희석하여 나타내었고, 50% Folin-ciocalteu reagent로 제조하여 사용하였다. 시료와 50% Folin-ciocalteu reagent를 1:1 비율로 혼합 후 3분간 실온에서 반응시키고 Na2CO3를 첨가하여1시간 동안 실온에서 반응하였다. 이후 반응이 끝난 용액을700 nm에서 흡광도를 측정하였다. 총 폴리페놀 함량은 100 g당 mg tannic acid equivalent (TAE)로 계산하여 결과값을나타내었다.

DPPH radical 소거능 측정

항산화 활성을 측정하기 위해 Blois의 방법[8]을 변형하여실험을 진행하였다. DPPH 시약은 99.9% EtOH를 이용하여180 µM로 희석하여 제조하였고, 제조된 시료 180 µl와 농도별로 희석된 시료를 30 µl 각 well에 넣은 후 15분간 실온에서 반응시키고 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 반응한 결과 값은 50% 감소시키는 시료의 농도인 IC50 값(µg/ml)으로표시하였으며, DPPH 라디칼 소거능은 시료의 첨가군에서무첨가군을 제외하여 백분율로 나타내었다.

전자공여능(%) = (1 − 시료첨가군/무첨가군 흡광도)×100

ABTS radical 소거능 측정

ABTS 라디칼을 이용한 항산화력 측정은 Re 등의 방법[9]을 변형하여 ABTS radical 소거능 실험을 진행하였다. 증류수를 용매로 사용하여 7 mM ABTS 시약과 2.45 mM K2S2O8시약을 교반하여 제조하였으며, 24시간 동안 차광병에 보관한 후 99% 에탄올로 희석하여 사용하였다. 희석한 ABTS 시약 100 µl와 시료 100 µl를 96 well plate에 넣어 반응시킨후 spectrometer를 이용하여 734 nm의 흡광도에서 측정하였다. 반응한 결과 값은 50% 감소시키는 시료의 농도인 IC50값(µg/ml)으로 표시하였으며, ABTS 라디칼 소거능은 시료의 첨가군에서 무첨가군을 제외하여 백분율로 나타내었다.

ABTS radical 소거능(%) = (1 − 시료첨가군/무첨가군 흡광도) × 100

세포주 및 세포 배양

본 실험에 사용된 세포주는 대식세포인 RAW 264.7 cell을 사용하였으며, 세포 배양에 사용된 DMEM 배지는 FBS (10%)와 penicillin/streptomycin (1%)를 첨가하여 사용하였다. 배양 조건으로는 incubator를 CO2 5%, 37℃로 설정하여80% 이상 성장한 세포를 계대 배양하여 사용하였다.

세포 생존율 측정(MTT Assay)

세포 생존율 측정은 Carmichael의 방법[10]을 이용하여 세포 생존율을 측정하였다. RAW 264.7 cell을 96 well plate에1×104 cells/well로 분주하여 24시간 동안 배양하였다. 배양된 세포 확인 후 농도별로 제조된 샘플을 각 well에 첨가하고 다시 24시간 동안 배양하였다. 여기에 2.5 mg/ml 농도로제조한 MTT 용액을 1 well 당 40 µl를 첨가하여 반응시켰다. 4시간 반응 후 상층액을 제거하고 각 well 당 DMSO 100 µl를 첨가하여 10분간 반응시킨 후 microplate reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 독성 측정은 시료용액의 첨가군과 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다.

세포생존율(%) = (1 − 시료첨가군/무첨가군 흡광도) × 100

NO 생성 억제 활성 측정

RAW 264.7 cell로부터 생성된 NO의 양은 Green 등의 방법[11]을 통해 측정하였다. 6 well plate에 3×105 cells/well로 분주하여 37℃, 5% CO2 조건에서 24시간 동안 배양하였다. LPS를 10 µg/ml 농도로 제조하여 단독처리군 및 시료 처리 구간에 첨가하여 2시간 동안 반응시켜 자극을 주었다. 이후 농도별로 제조한 시료에 처리하고 18시간동안 배양시켜준 후 상층액 100 µl와 griess 시약 100 µl를 10분간 반응시켰다. 반응시킨 용액을 microplate reader를 통해 540 nm의흡광도에서 측정하였으며, nitrite standard solution에서 얻어진 standard curve를 이용하여 산출하였다.

NO 생성 억제 활성(%) = (1 − 시료첨가군/무첨가군 NO 생성량) × 100

Western blot을 통한 단백질 발현 측정

염증 인자인 iNOS, COX-2의 활성을 알아보기 위해 RAW 264.7 cell을 100 mm tissue culture dish에 cell seeding후 37℃, 5% CO2 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후 염증유도물질인 LPS를 10 µg/ml 처리를 하여 2시간반응시켰고, 2시간 후 시료를 첨가하여 18시간 동안 반응시켜 자극을 주었고, 상등액을 제거한 후 PBS로 2회 세척하였다. RIPA buffer 10 ml에 Protease & Phosphatase Single-Use Inhibitor Cocktail (100×) 100 µl를 혼합하여 제조한lysis buffer로 세포막을 용해하고 4℃, 13,200 rpm으로20분간 원심 분리를 진행하였다. 원심 분리 후 얻은 상층액은 BCA protein assay kit를 이용하여 단백질을 정량하였고, 20 µl의 단백질을 10% SDS acrylamide gel에서 120 V, 90분동안 전기영동을 통해 분리하였다. 분리된 단백질은transfer 기기를 이용하여 polyvinylide fluoride (PVDF) membrane에 옮긴 뒤 실온에서 1시간 동안 tris-buffered saline & tween 20 (TBST)에 녹인 5% skim milk를 이용하여 blocking 하였다. iNOS, COX-2의 primary antibody를희석하여 4℃에서 overnight으로 진행한 후, 10분 간격으로TBST로 3회 세척한 후 secondary antibody는 온에서 90분간 반응시켰으며 다시 TBST로 3회 세척하여 ChemiDocTM MP Imaging System을 이용하여 밴드를 확인하였다.

Reverse Transcription-PCR (RT-PCR)

염증 관련 인자인 iNOS, COX-2에 대한 mRNA 발현에 끼치는 영향을 알아보기 위해 RT-PCR을 진행하였다. COX-2인자는 PCR PreMix에 합성한 cDNA와 primer를 충분히 섞어 실험을 진행하였고, GAPDH와 iNOS는 PCR tube에 5X Green GoTaq flexi buffer, MgCl2, PCR nucleotide mix (10 mM), primer, Go Taq DNA polymerase, NW 및 합성한 cDNA를 첨가하여 PCR을 측정하였다. 이때 사용한primer sequences는 Table 1에 나타내었다. COX-2는 96℃에서 2분, 94℃에서 10초 51℃에서 30초, 72℃에서 10분(35 cycles)을 실행하였고, GAPDH는 96℃에서 2분, 94℃에서10초, 64℃에서 30초, 72℃에서 1분, 72℃에서 10분(30 cycles), iNOS는 96℃에서 2분, 94℃에서 10초, 62℃에서 30초, 72℃에서 1분, 72℃에서 10분(30 cycles)을 실행하였다. PCR로 합성시킨 후, 0.005%에서 ethidium bromide (EtBr)를 첨가한 1.5% agarose gel을 100 V에서 20분 전기영동 시켜ChemiDoc MP Imaging System을 이용하여 각 mRNA 발현을 확인하였다.

Table 1 . Sequence of the primers used for RT-PCR.

GenePrimerSequence (5’ → 3’)
GAPDHsenseTGA AGG TCG GTG TGA ACG GAT TTG GC
Anti-senseCAT GTA GGC CAT GAG GTC CAC CAC
iNOSsenseAAT GGC AAC ATC AGG TCG GCC ATC ACT
Anti-senseGCT GTG TGT CAC AGA AGT CTC GAA CTC
COX-2senseGGA GAG ACT ATC AAG ATA GT
Anti-senseATG GTC AGT AGA CTT TTA CA


통계 처리

모든 실험은 3회 반복 실행하여 평균치와 표준편차를 이용하여 나타내었다. 결과 통계처리는 SPSS23 (SPSS Inc, USA) software를 사용하여 t-test 실시 후 유의값(*p<0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001)을 나타내었으며, 유의차 검증은 분산분석(analysis of variance ANOVA)을 한 후 Duncan’s multiple에 의해 p < 0.05 수준에서 나타냈었다.

총 폴리페놀 함량

페놀성 화합물에 포함되어 있는 phenolic hydroxyl (OH)기는 단백질 등에 결합하는 특성을 가지며 항산화, 항염 및항암 효과 등의 생리활성 기능을 가지고 있다고 보고된다[12,13].

총 폴리페놀 함량을 측정하기 위해 표준물질로 tannic acid를 사용하였고 표시는 추출물 100 g 당 tannic acid의 양을환산하였다. 카이란의 열수 및 70% 에탄올 추출물의 폴리페놀 함량 결과는 Table 2와 같이 나타났다. 카이란 열수 추출물은 124.34 ± 0.19 mg/100 g, 70% 에탄올은 144.10 ± 0.73 mg/100 g의 함량을 갖고 있는 것을 확인하였다.

Table 2 . Total phenolic content on kailan (Brassica oleracea L.) extracts.

KRDKRE
Total polyphenol (mg TAE/100 g)124.34 ± 0.19144.10 ± 0.73

Values represent the mean ± SD of three independent measurements.

KRD, Kailan extracted with distilled water at 100℃; KRE, Kailan extracted with 70% ethanol at room temperature.



전자공여능

DPPH는 안정한 라디칼인 DPPH가 항산화물질의 의해 전자 혹은 수소를 제공받게 되면 탈색반응이 일어나게 되며,흡광도가 517 nm일 때 피크를 나타나는 특성을 이용하여 항산화 물질의 측정에 사용된다[14].

카이란 열수 및 70% 에탄올 추출물의 전자공여능 측정 결과는 Fig. 1과 같이 나타내었다. 항산화제로 알려진 vitamin C를 대조군으로 사용하였으며, IC50 값은 6.18 ± 0.04 µg/ml이었으며, 카이란 열수 및 70% 에탄올 추출물의 IC50 값은각각 805.97 ± 1.1 µg/ml, 489.57 ± 0.77 µg/ml로 나타났다.또한 DPPH 라디칼 소거능은 최종 농도인 1,000 µg/ml에서61.04%와 84.53%의 전자공여능이 나타나는 것을 확인하였다. Song 등[14]의 연구에서 세레늄 강화 시금치와 무처리시금치의 DPPH 라디칼 소거능을 측정한 결과, 1,000 µg/ml 농도에서 각각 59.09%, 52.75%의 소거 효과를 나타내었다. 이와 비교하였을 때, 카이란 열수 및 70% 에탄올 추출물이 같은 농도에서 높은 활성을 나타내어 우수함을 확인하였다.

Figure 1.Fig. 1

ABTS radical 소거능

ABTS 라디칼 소거능은 potassium persulfate가 ABTS의 산화에 의해 라디칼을 형성하여 항산화 물질에서 전자를 받아 색이 옅어지는 과정을 통해 항산화능을 측정하는 방법이다[15].

카이란 열수 및 70% 에탄올 추출물의 ABTS 라디칼 소거능 측정 결과는 Fig. 2와 같이 나타났다. Vitamin C를 대조군으로 사용하였으며, IC50 값은 23.32 ± 0.1 µg/ml이었으며, 카이란 열수 및 70% 에탄올 추출물의 IC50 값은 각각549.13 ± 3.26 µg/ml, 489.57 ± 1.78 µg/ml로 나타났다. 또한ABTS 라디칼 소거능은 1,000 µg/ml 89.13%와 98.61%의 소거능이 있는 것으로 나타났고 두 추출물 모두 농도의존적으로 항산화능이 나타나는 것을 확인하였다. Kim의 연구에서는 브로콜리 잎 추출물의 ABTS 라디칼 소거능을 측정한 결과, 10,000 μg/ml에서 99.84%의 높은 소거능을 나타냈다고보고하였다. 본 연구와 같은 농도에서 1,000 μg/ml에서는30% 이하의 소거능을 나타내어 카이란 열수 및 70% 에탄올추출물이 더 우수함을 확인하였다.

Figure 2.Fig. 2

세포 생존율(MTT Assay)

세포 생존율을 측정하기 위해 MTT assay를 사용하였다. MTT assay는 미토콘드리아 속의 탈수소 효소 작용을 이용하여 MTT tetrazolium을 불용성 formazan으로 환원시키는것을 이용하여 세포 생존율을 측정하는 실험이다[16].

RAW 264.7 세포에서의 카이란 열수 및 70% 에탄올 추출물의 세포 생존율을 Fig. 3와 같이 나타났으며, RAW 264.7세포에서 카이란 열수 및 70% 에탄올 추출물 모두 100 µg/ml 농도에서 90% 이상의 생존율을 보였다. 이를 토대로 이후 세포실험은 세포생존율이 90% 이상인 구간의 농도로 설정하여 진행하였다.

Figure 3.Fig. 3

NO 생성 억제 활성

NO는 다양한 분자들과 반응성이 높은 unpaired electron을 갖고 있으며, 가벼운 성질로 인해 확산이 자유롭게 이루어진다. 이로 인해 다른 reactive species를 주고 받으며 산화반응과 항산화 반응이 일어나게 된다. 이러한 NO는 대식세포의 활성화로 인해 다량 발생되면 림프구, 미생물, 종양세포 등에 독성작용을 나타내어 염증 반응 및 세포손상을 유발하게 된다[17].

카이란 추출물에 대한 항염증 효과 확인하고자 대식세포인 RAW 264.7 cell에 염증을 유도하여 NO 생성 억제 효과를 확인하였다. NO 생성 저해 활성 측정 결과 Fig. 4와 같이나타났으며 무처리군과 LPS 단독 처리군과의 차이가 나타나는 것을 확인하였다. 카이란 열수 및 70% 에탄올 추출물은 LPS 단독 처리군 대비 농도의존적으로 NO 생성 저해 활성을 보였으며, 100 µg/ml 농도에서 29.90%와 40.94%의 저해 활성을 확인하였다. Lee 등[18]의 연구에서 유산균 발효양배추의 NO 생성량을 확인한 결과, LPS 단독 처리군을 기준으로 100 µg/ml 농도에서 14.57%의 생성이 감소되었다.이 결과와 비교하였을 때, 카이란 추출물은 같은 농도에서2배 이상의 저해 활성을 나타내어 NO 저해 활성이 우수함을 확인하였다.

Figure 4.Fig. 4

Western blot을 통한 iNOS 및 COX-2에 대한 단백질 발현억제 효과

다른 NOS 종류들과 달리 iNOS는 보통 때는 발현되어 있지 않다가 cytokine이나 외부자극 등에 의해 생성되며, 다양한 세포(monocytes, macrophages, hepatocytes, bone marrow cells 등)에서 발현된다고 알려져 있다. 이 중 염증반응에 대표적으로 관여하는 세포는 macrophages로 알려져있으며, iNOS가 발현되었을 때, NO를 다량으로 생산되어져신체에 치명적인 자극을 일으킨다[18].

Arachidonic acid가 세포막 인지질에 의해 유리되었을 때prostaglandin의 생성을 촉진하는 효소인 COX는 COX-1과COX-2가 존재한다. 이 중 COX-2는 LPS, growth factors 등자극에 의해 다량으로 생성되어 혈관생성 유도를 통한 종양생성 및 종양의 세포사멸 억제 등에 기여한다[19].

염증발현 인자인 iNOS와 COX-2의 단백질 발현 억제 효과를 확인하기 위해 Western blot을 사용하여 측정하였다. RAW 264.7에 카이란 추출물을 10, 50, 100 µg/ml 농도별로처리하여 24시간 후 단백질 발현 억제 효과를 측정한 결과Fig. 5와 같았으며, positive control로는 housekeeping gene인 β-actin을 사용하였다. 카이란 열수 및 70% 에탄올 추출물의 결과 두 추출물 모두 농도의존적으로 억제됨을 확인하였으며, COX-2의 억제 효과 측정 결과 100 µg/ml 농도에서52.85%와 96.11%의 억제율을 확인하였고 iNOS의 억제 효과 측정 결과 100 µg/ml 농도에서 12.13%와 18.73%의 억제율을 확인하였다.

Figure 5.Fig. 5

RT-PCR을 통한 iNOS 및 COX-2에 대한 mRNA 발현 억제효과

iNOS와 COX-2의 mRNA 발현 억제 효과를 측정하기 위하여 RT-PCR을 이용하여 실험을 진행하였다. LPS로부터 자극받은 RAW 264.7 세포에 카이란 열수 및 에탄올 추출물을처리한 후 각 mRNA의 발현 억제를 측정한 결과는 Fig. 6에나타내었다. 이 때 housekeeping gene인 GAPDH을 positive control로 사용하였다 iNOS의 열수 및 70% 에탄올 추출물결과 100 µg/ml 농도에서 92.74%와 76.86%의 mRNA 발현율이 측정되었고 COX-2의 열수 및 70% 에탄올 추출물 결과 100 µg/ml 농도에서 98.16%와 92.74%의 발현율을 확인하였다.

Figure 6.Fig. 6

본 연구는 카이란에 대한 생리활성 연구는 아직 미비한 실정이므로 카이란을 이용하여 항산화 및 항염증 효능을 확인하기 위해 수행되었다. 카이란 열수 및 70% 에탄올 추출물의 폴리페놀 함량과 항산화 측정을 통해 항산화력이 있음을확인하였고, LPS로 자극받은 대식세포 내에서 염증 발현 인자의 억제를 확인함으로써 항염증에도 효과가 있음을 확인하였다. 따라서, 카이란을 천연 기능성 소재로 활용할 수 있는 기초적 자료로 보고하고자 한다.

본 연구를 통해 카이란(Brassica oleracea L.)의 열수 추출물과 70% 에탄올 추출물의 항산화 및 항염 효과를 측정한결과, 두 추출물 모두 항산화 및 항염에 효과를 가진 것으로확인되었다. 카이란(Brassica oleracea L.)의 열수 추출물과70% 에탄올 추출물의 실험 결과 총 폴리페놀 함량에서는124.19 ± 0.19 mg/100 g, 144.10 ± 0.73 mg/100 g의 함량을확인하였다. 열수 추출물과 70% 에탄올 추출물의 항산화 실험 결과 전자공여능 측정에서 1,000 µg/ml 농도에서 61.04%와 84.53%의 전자공여능이 나타나는 것을 확인하였고, ABTS 라디칼 소거능측정에서는 1,000 µg/ml 농도에서 89.13%와98.61%의 소거능이 있는 것으로 확인하였다. 카이란의 열수추출물과 70% 에탄올 추출물의 세포생존율 측정 결과, RAW 264.7 세포에서 100 µg/ml 농도에서 90% 이상의 세포생존율을 확인하였다. 카이란의 열수 추출물과 70% 에탄올 추출물의 NO 생성 저해 활성 측정 결과 100 µg/ml 농도에서29.90%와 40.94%의 저해 활성을 확인하였다. LPS로 유도된 RAW 264.7 cell 대식세포에 대한 단백질 발현 억제 효과측정 결과 카이란의 열수 추출물과 70% 에탄올 추출물의COX-2의 억제 효과율은 100 µg/ml 농도에서 52.85%와96.11%의 억제효과를 나타내었고 iNOS의 억제 효과율은 100 µg/ml 농도에서 12.13%와 18.73%의 억제율을 확인하였다. RT-PCR mRNA 측정 결과 카이란(Brassica oleracea L.)의 열수 추출물과 70% 에탄올 추출물의 COX-2에서 100 µg/ml 농도에서 98.16%와 92.74%의 발현이 측정되었고iNOS에서는 92.74%와 76.86%의 발현이 측정되었다. 카이란 추출물의 실험 결과 두 추출물 모두 ABTS 라디칼 소거능 실험에서 대조군인 Vit. C 보다 좋은 효과를 보여 항산화능을 확인하였고 염증 발현 인자인 iNOS와 COX-2에 대해 단백질 발현 억제와 mRNA 발현에 대해 우수한 효능을 확인하였다. 위와 같은 결과들을 토대로, 카이란 추출물이 항산화, 항염 효과를 가진 것을 확인하여 향후 항산화 및 항염천연 소재로 활용 가능성 및 가치를 가진 것으로 사료된다.

The authors have no financial conflicts of interest to declare.

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