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Microbiology and Biotechnology Letters

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Molecular and Cellular Microbiology (MCM)  |  Functional Genomics and Systems Biology

Microbiol. Biotechnol. Lett. 2022; 50(2): 277-282

https://doi.org/10.48022/mbl.2111.11011

Received: November 26, 2021; Revised: March 29, 2022; Accepted: May 26, 2022

팥 껍질 추출물의 미백 기능성 활성 검증

A Study of Whitening Functional Activity Verification from Red Bean (Phaseolus angularis) Shell Extract

Soo-Yeon Lee1, Min-Jeong Oh2, Hyeon-Ji Yeom2, and Jin-Young Lee2*

1Division of Bio-Technology and Convergence, Daegu Haany University, Gyeongbuk 38578, Republic of Korea
2Division of Cosmetics and Biotechnology, Hoseo University, Chungnam 31499, Republic of Korea

Correspondence to :
jin-Young Lee,       jylee@hoseo.edu

Whitening effect of the extract of Phaseolus angularis (PA) shell was investigated for its potential application as a functional ingredient for cosmetic products. The tyrosinase inhibitory effect, which is related to whitening, was 76.4% at a concentration of 1,000 μg/ml. Cell viability of melanoma cells was measured to test toxicity of the PA shell extract at concentrations showing at least 90% viability. In addition, western blot and RT-PCR assays of the PA shell extract showed concentration-dependent decreases of MITF, TRP-1, TRP-2 and tyrosinase protein and inhibitory effect of mRNA expression. These findings suggested that extract from PA shell has great potential as a cosmeceutical ingredient with whitening effect.

Keywords: Phaseolus angularis Shell, whitening effect, melanoma cell, skin pigmentation

Graphical Abstract


표피의 기저층에 존재하는 멜라닌(melanin)은 페놀류가산화효소에 의해 산화되어 유도된 갈색 또는 흑색 고분자 색소를 말하며, 인간의 눈동자, 머리카락, 피부의 색을 결정하고 자외선이나 환경오염, 그 외의 외부자극요인으로부터 피부를 보호하려는 방어기전으로 생성된다[1, 2]. 멜라닌 세포는 자외선, 염증 등과 같은 외부조건, α-melanocyte stimulating hormone (α-MSH) 등의 호르몬, interleukin 1 (IL-1), TNF-α, GM-CSF 등의 cytokine 및 leukotriene 등여러 인자들의 영향을 받고 있다[3]. 멜라닌 합성은 표피에분포한 melanocyte의 melanosomes에서 이뤄져 이는keratinocyte 등과 밀접한 세포간 정보망을 구성하고 있으며,아미노산의 하나인 tyrosine으로부터 시작해 melanocyte의수적 증가에 의하여 비례하고 tyrosinase 효소 활성도의 증가에 의해 결정된다. 즉, tyrosinase가 L-tyrosine를 거쳐3,4-dihydroxyphenyl-alanine (L-DOPA)의 산화를 촉매시켜 DOPA quinone을 생성[4], tyrosinase, tyrosinase related protein 1 (TRP-1) 및 tyrosinase related protein 2 (TRP-2) 등의 효소반응에 의해 갈색~검정색을 띄는 유멜라닌(euumelanin)과 노랑색~붉은색을 띄는 페오멜라닌(pheomelanin)이 합성된다[5, 6]. 멜라닌 생성 관련 핵심 전사인자인 microphthalmia-associated transcription factor (MITF)는 핵으로 이동하여 TRP-1과 TRP-2의 promoter를활성화시킴으로써 멜라닌 생성속도 조절 단계 효소인tyrosinase의 발현을 조절하게 되고 tyrosinase의 발현이 멜라닌 생성을 촉진시키는 것이다[7-12]. 또한 피부는 외부 환경으로부터 쉽게 접촉이 가능한 위치의 조직으로써, 인체의 물리적·생화학적 방어기능을 수행하는 조직 중의 하나이다[13].

팥(small red bean, adzuki (azuki) bean, Phaseolus angularis)은 쌍떡잎식물 장미콩과(Fabaceae)에 속하는 한해살이 작물로 한국, 중국, 일본 등 극동아시아의 온대지역에서주로 재배되고 있으며 우리나라에서 콩 다음으로 수요가 많은 두류로서[14], 팥 껍질에는 아린 맛을 내는 시아니딘 배당체와 사포닌 성분들이 다량 함유되어 있을 뿐 아니라 trypsin저해와 같은 생육억제인자를 다량 포함하고 있다[15, 16].

지금까지 팥의 여러가지 효능에 대한 연구는 많이 이루어져 왔지만 팥 껍질에 대한 활성 및 효능에 관한 연구는 거의 이뤄지지 않고 있다. 따라서 본 연구에서는 팥의 부산물인 팥껍질에 대한 미백 실험을 통해 그 효능을 확인하고자 한다.

재료 및 시료 추출

시료의 추출은 팥으로부터 껍질만을 채취하여 70% 에탄올을 이용해 추출을 실시하였다. 팥의 겉 표면에 생채기를낸 후 24시간 동안 차가운 물에 담가 두어 팥을 불린 후 팥껍질과 알맹이를 분리하여 껍질만 모아 건조기를 사용하여팥 껍질을 건조하였다. 건조된 팥 껍질에 70% 에탄올을 10배의 양으로 가하여 실온에서 24시간 침지 후 상등액과 침전물을 나누어 추출하였으며 여과지(Whatman No.2)를 이용하여 시료 추출물을 여과하였다. EYELA evaporator로 감압농축하고 용매를 완전히 제거한 후 동결 건조하여 -20℃에서 보관하며 본 실험의 시료로 사용하였다.

시약 및 기기

미백 효과 측정에 사용된 시약인 tyrosinase mushroom과L-3,4-dihydroxy-phenyl-alanine (L-DOPA) 등은 Sigma Chemical Co. (USA)에서 구입하였다. 또한, 단백질 발현 효과를 측정하기 위해 사용한 β-actin, MITF, TRP-1, TRP-2및 tyrosinase의 primary antibody와 rabbit-anti-mouse, goat-anti–rabbit 등 secondary antibody는 Santa cruz (USA)에서 구입하여 사용하였다. 실험에 사용된 기기는rotary vacuum evaporator (EYELA, Japan), freeze drier (ILShin BioBase Co., Korea), UV/VIS spectrophotometer (Hitachi, Japan), centrifuge (Hanil Science Industrial Co., Korea), microcentrifuge (gyrozen, South Korea), microscope (Olympus, Japan), CO2 incubator (Vision Scientific, Korea), vortex (Scientific Industries, Inc., USA), pH meter (Mettler-Toledo AG, Switzerland), autoclave (JS Research Inc., South Korea), microplate reader (Tecan, Austria), PCR (ASTEC Co., Japan), Davinch-Chemi™ Imager CAS-400SM System (Davinch-K Co., Korea), UV transilluminator (BioTop, Switzerland), Mini-PROTEAN® tetra cell (Bio-Rad, USA), Mini Trans-Blot® Cell (Bio-Rad, USA), digital shaker (Deihan Scientific, Korea)을 사용하였다.

세포 배양과 세포 독성 측정에 사용된 세포주는 마우스 흑색 세포종인 B16F10은 American Type Culture Collection (ATCC, USA)에서 구입하여 사용하였다. 세포 배양에 사용된 dulbecco’s modified eagle medium (DMEM)과 fetal bovine serum (FBS), phosphate buffered saline (PBS), penicillin/streptomycin 및 trypsin은 thermo scientific hyclone (USA) 및 Gibco BRL Co. (Grand Island, USA)에서 구매 후 사용하였다. 세포 독성 측정에 사용된haemacytometer (Marienfeld, Germany), 3-[4,5-dimethylthiazol]-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT)는 Sigma-Aldrich Corporation (USA)에서 구매, dimethyl sulfoxide (DMSO)는 BioShop (Canada)에서 구입하여 사용하였다.

Tyrosinase 저해활성 측정

Tyrosinase 저해활성 측정은 Yagi 등의 방법[17]에 따라측정하였다. 반응구는 67 mM sodium phosphate buffer (pH 6.8) 80 μl에 10 mM L-DOPA (Sigma, USA)를 녹인기질 액 40 μl 및 시료용액 40 μl의 혼합액에 200 U/ml mushroom tyrosinase (Sigma) 40 μl을 첨가하여 37℃에서10분간 반응시켜 반응액 중에 생성된 DOPA chrome을492 nm에서 측정하여 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 tyrosinase 저해활성을 나타내었다.

(%)=(1- )×100

세포 배양

본 실험에 사용된 각 세포의 배양을 위하여 10%의 FBS와1%의 penicillin/streptomycin (100 U/ml)을 가한 DMEM배지를 사용하였으며, 37℃, 5% CO2 incubator의 조건에서적응시켜 계대 배양하였다.

MTT assay에 의한 멜라노마 세포의 생존율 측정

세포 생존율 측정 실험은 Carmichael의 방법[18]에 따라시행하였다. 독성을 측정할 멜라노마 세포(B16F10)를96 well plate에 1×105 cells/well이 되도록 0.18 ml로 분주한 후, 농도별로 조제한 시료용액 0.02 ml를 첨가하여 37℃의 5% CO2 incubator에서 24-48시간 배양하였다. 대조군은시료 용액과 같은 양의 무혈청 배지를 첨가하여 동일한 조건에서 배양하였다. 여기에 2.5 mg/ml 농도로 제조한 MTT용액 0.04 ml을 첨가하여 37℃ 5% CO2 incubator에서 다시 3시간 배양한 후 배양액을 제거하고 각 well당 DMSO 0.1 ml를 가하여 실온에서 30분간 반응시킨 다음 microplate reader로 540 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 세포생존율은 시료첨가군과 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다.

(%)=(1- )×100

Western blot을 통한 단백질 발현 측정

MITF, TRP-1, TRP-2 및 tyrosinase의 활성을 보기 위하여 cell line (B16F10)을 100 mm tissue culture dish에seeding한 후 24시간 동안 배양하여 세포를 안정화시켰다.배지를 suction한 후 추출물을 농도별로 처리한 배지로 24- 48시간 배양, 다시 배지를 suction하여 phosphate buffered saline (PBS)를 이용하여 2회 세척하였다. 10 ml의 radio-immunoprecipitation assay (RIPA) buffer에 complete mini 1 tab를 가한 100 μl로 용해해서 20분간 4℃, 13,200 rpm의 조건에서 원심 분리하였다. 원심 분리하여 얻은 상층액은 BCA protein assay kit를 이용해 정량 후 10% SDS-PAGE 상에서 전기 영동 하여 분리하였다. 분리된 단백질은polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane에 옮겨 상온에서 1시간동안 blocking buffer (5% skim milk in tris-buffered saline and tween 20, TBST)에서 반응시켰다. 희석한 1차 항체를 4℃에서 over night한 다음, TBST를 이용하여 10분 간격으로 3회 세척하고 1:2,000로 희석한 2차 항체를 실온에서 2시간 반응시켰다. 그 후 동일 조건에서 세척한 다음 Davinch-Chemi™ Imager CAS-400SM 기기를 이용하여 밴드를 확인하였다.

Total RNA 분리 및 cDNA 합성

세포를 100 mm culture dish에 cell seeding한 뒤 24시간동안 배양한 후 추출물을 농도 별로 처리한 배지로 다시24시간 배양하였다. 배지 상등액을 suction한 후 각 well에trizol lysis buffer를 1 μl씩 가하여 세포를 lysis 한 후200 μl의 chloroform을 분주하여 20-30초간 위아래로 흔들어주었다. 그 후 20분간 4℃의 13,200 rpm 조건에서 원심 분리하여 얻은 상층액을 isopropanol 500 μl이 담겨있는 튜브에 옮겨 섞어주었다. 다시 4℃의 13,200 rpm에서 20분간 원심분리 하였고, 그 상층액을 소거한 후 75% EtOH-diethylpyrocarbonate water를 각각의 튜브에 1 ml씩 분주하여 원심 분리한 뒤 상층액을 제거하고 실온에서 건조하였다. DEPC 50 μl를 이용하여 녹인 후 96 well plate에 RNA 5 μl와 멸균수 195 μl를 가하여 260 nm, 280 nm에서 각각의 흡광도를 측정하고 total RNA 양을 측정하였다. Oligo (dT) 15 primer (500 μg/ml) 1 μl와 추출한 RNA (2 μl) 및nuclease free water로 10 μl를 맞추고 75℃에서 5분간 반응시켰다. 그 후 5X reaction buffer와 MgCl2, PCR nucleotide mix, rnasin inhibitor, reverse transcriptase 및 nuclease free water를 첨가하여 25℃에서 5분, 42℃에서 60분, 70℃에서 15분간 반응시켜 cDNA를 합성시켰다.

Reverse transcription-polymerase chain reaction

MITF, TRP-1, TRP-2 및 tyrosinase의 mRNA 발현정도를 알아보기 위하여 polymerase chain reaction (PCR)을 진행하였다. 실험에 사용한 primer sequences는 Table 1과 같다. PCR tube에 Go Flexi DNA polymerase, primer, 합성한 cDNA를 첨가하여 잘 섞은 후 PCR을 실행하였다. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)는94℃에서 30초, 55℃에서 45초, 72℃에서 45초(35 cycles), tyrosinase는 94℃에서 30초, 60℃에서 45초, 72℃ 45초(40 cycles), TRP-1, TRP-2, MITF는 94℃에서 30초, 58℃에서 45초, 72℃에서 45초(40 cycles)을 하였다. 그 후 100 V의조건에서 0.002% ethidium bromide를 첨가한 1.5% agarose gel을 40분간 전기 영동하였고 UV transilluminator를 이용하여 밴드를 확인하였다.

Table 1 . Sequence of the Primers Used for RT-PCR.

GenePrimerSequence (5’ →3’)
MITFForwardAGC GTG TAT TTT CCC CAC AG
ReverseTAG CTC CTT AAT GCG GTC GT
TRP-1ForwardACT TCA CTC AAG CCA ACT GC
ReverseAGC TTC CCA TCA GAT GTC GT
TRP-2ForwardGCT CCA AGT GGC TGT AGA CC
ReverseAAT GCA GTG GCT TGG AAA TC
TyrosinaseForwardGAC GGT CAC TGC ACA CTT TG
ReverseGCC ATG ACC AGG ATG AC
GAPDHsenseTGA AGG TCG GTG TGA ACG GAT TTG GC
anti-senseCAT GTA GGC CAT GAG GTC CAC CAC

Tyrosinase 저해활성 측정 결과

팥 껍질 추출물의 tyrosinase 저해활성을 확인한 결과 Fig. 1과 같다. 팥 껍질 추출 1,000 μg/ml의 농도에서 76.39%의 저해효과를 확인할 수 있었다. 이는 Kwak [19]의 연구에서선화 잎의 열수추출물과 에탄올 추출물은 tyrosinase에 대한저해활성이 없고, 팥 껍질 추출물과 같은 농도에서 선화 뿌리의 열수 추출물과 에탄올 추출물이 각각 8.2%, 14.9%의 낮은 저해 효과를 확인한 연구 결과와 비교하였을 때 팥 껍질추출물의 우수한 tyrosinase 저해 활성을 확인할 수 있었다.

Figure 1.Inhibition rate of extract from Phaseolus angularis shell on tyrosinase. Result are means ± SD. of triplicate data.

MTT assay에 의한 멜라노마 세포의 생존율 측정 결과

이하 세포 관련 실험을 위해 팥 껍질 추출물이 멜라노마 세포(B16F10)의 세포 생존율을 확인한 결과 Fig. 2와 같다. 100 μg/ml의 농도에서 팥 껍질 추출물은 100%에 가까운 우수한 세포 생존율을 보였다. 따라서 이후 팥 껍질 추출물의멜라노마 세포(B16F10)에서의 미백관련 신호전달 인자 측정은 생존율이 95% 이상인 25, 50, 100 μg/ml 농도에서 진행하였다.

Figure 2.Cell viability of extract from Phaseolus angularis shell on melanoma cell (B16F10). Result are means ± SD. of triplicate data.

멜라닌 합성에 관여하는 MITF, TRP-1, TRP-2 및 tyrosinase단백질 및 mRNA 발현 측정 결과

팥 껍질 추출물이 멜라닌 합성에 영향을 미치는 인자인MITF, TRP-1, TRP-2 및 tyrosinase 단백질 발현량을 알아보기 위해 멜라노마 세포(B16F10)에 25, 50, 100 μg/ml 농도의 팥 껍질 추출물을 처리한 후 24시간 반응시켜 western blot으로 확인하였다. 이때 positive control은 세포의 어느 조건에서도 발현 정도의 차이가 거의 없는 house keeping gene인 β-actin을 사용하였다. 그 결과, Fig. 3-6과 같이 MITF, TRP-1, TRP-2 및 tyrosinase의 단백질 발현은 농도별로 팥껍질 추출믈을 처리한 멜라노마 세포(B16F10)군에서 감소하였고, 대조군 kojic acid와 비교하였을 때 발현량이 유의한것을 확인할 수 있었다. 특히, Fig. 5-6과 같이 TRP-2, tyrosinase의 단백질 발현정도가 100 μg/ml 농도에서 대조군보다 더욱 억제된 결과를 확인하였다.

Figure 3.MITF protein and mRNA expression rate of extract from Phaseolus angularis shell on melanoma cell (B16F10). After B16F10 cells (5 × 105 cells) were started in serum free medium for 1 h the cells were treated with 25, 50 and 100 μg/ml of Phaseolus angularis shell for 24 h. Each values represents mean ± SD of three individual experiments (**p < 0.01, ***p < 0.001).

Figure 4.TRP-1 protein and mRNA expression rate of extract from Phaseolus angularis shell on melanoma cell (B16F10). After B16F10 cells (5 × 105 cells) were started in serum free medium for 1 h the cells were treated with 25, 50 and 100 μg/ml of Phaseolus angularis shell for 24 h. Each values represents mean ± SD of three individual experiments (**p < 0.01, ***p < 0.001).

Figure 5.TRP-2 protein and mRNA expression rate of extract from Phaseolus angularis shell on melanoma cell (B16F10). After B16F10 cells (5 × 105 cells) were started in serum free medium for 1 h the cells were treated with 25, 50 and 100 μg/ml of Phaseolus angularis shell for 24 h. Each values represents mean ± SD of three individual experiments (**p < 0.01, ***p < 0.001).

Figure 6.Tyrosinase protein and mRNA expression rate of extract from Phaseolus angularis shell on melanoma cell (B16F10). After B16F10 cells (5 × 105 cells) were started in serum free medium for 1 h the cells were treated with 25, 50 and 100 μg/ml of Phaseolus angularis shell for 24 h. Each values represents mean ± SD of three individual experiments (**p < 0.01, ***p < 0.001).

또한 MITF, TRP-1, TRP-2 및 tyrosinase의 mRNA 발현량을 알아보기 위해 멜라노마 세포(B16F10)에 팥 껍질 추출물을 25, 50, 100 μg/ml의 농도로 처리한 후 24시간 반응시켜 RT-PCR으로 mRNA 발현억제율을 확인하였다. 이때positive control은 세포 어느 조건에서도 그 발현 정도의 차이가 거의 없는 house keeping gene인 GAPDH를 사용하였다. 그 결과 Fig. 3-6과 같이 MITF, TRP-1, TRP-2 및tyrosinase의 mRNA 발현량은 팥 껍질 추출물을 25, 50, 100 μg/ml의 농도별로 처리한 멜라노마 세포(B16F10)군에서 더욱 감소하였으며, 대조군 kojic acid와 비교하였을 때특히 100 μg/ml 농도에서 우수한 mRNA 발현 억제율을 나타내었다.

본 연구는 한국, 중국 등 극동아시아의 온대지역에서 재배되고 우리나라에서는 콩 다음으로 수요가 많은 팥 껍질(Phaseolus angularis shell)의 미백 효과를 검증하여 화장품소재로서의 가능성을 확인하고자 하였다. 팥 껍질의 효능을screening 하기 위하여 효소 실험인 tyrosinase 저해활성을측정한 결과 1,000 μg/ml의 농도에서 76.39%의 저해활성을나타내었다. 이후 멜라노마 세포의 생존율을 측정하여 팥 껍질이 세포에 독성을 미치지 않는 생존율 90% 이상의 농도에서 세포 실험을 진행하였다. 팥 껍질 추출물이 멜라닌 합성에 영향을 미치는 인자인 MITF, TRP-1, TRP-2, tyrosinase단백질 및 mRNA 발현 억제 효과를 측정한 결과 모든 인자에서 발현량이 감소하였으며 대조군으로 사용된 kojic acid와 비교하였을 때 발현 정도가 유의하거나 더 감소한 것을확인할 수 있었다. 이러한 결과, 팥 껍질 추출물의 미백 활성이 우수하다는 것을 확인할 수 있었으며 이는 미백 기능성화장품 소재로서 활용 가능성이 있을 것으로 사료된다.

The authors have no financial conflicts of interest to declare.

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